胚胎期豚鼠前庭终器细胞凋亡的检测

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1、胚胎期豚鼠前庭终器细胞凋亡的检测关键词:前庭终器;脱噬作用;生长和胚胎发育摘要:目的研究豚鼠胚胎正常发育期前庭终器形态变化及细胞凋亡，探讨细胞凋亡在前庭终器发育中的作用.方法选用胚胎40和50d正常豚鼠，光镜观察其前庭终器发育形态变化，末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）测定毛细胞和支持细胞凋亡，并以电镜观察凋亡细胞胞核变化.结果胚胎40d，豚鼠前庭壶腹、椭圆囊斑及球囊斑已分化，前庭上皮出现一层毛细胞及多层支持细胞;胚胎50d，支持细胞层数减少，毛细胞数目增加，伴有神经纤维出现.TUNEL检测提示大量毛细

2、胞和支持细胞发生凋亡.电镜下前庭上皮细胞发生分化，凋亡的毛细胞和支持细胞胞核染色质浓缩边集.凋亡细胞与新生细胞相邻.结论细胞凋亡是豚鼠内耳前庭终发育的必然现象，凋亡的发生对保证内耳正常结构和功能密切相关.　　Key-bryonicdevelopment　　Abstract:AIMThemorphologicalchangesandcellapopto-sisofvestibularorganinnormallydevelopingguineapigs-bryonicday（ED）40and50orphologicalchangesint

3、hevestibularorganicro-scopeandapoptosisbyTdT-mediateddeoxyuridinetriphos-phate-biotinnickendlabelling（TUNEL）methodandtrans-missionelectromicroscopy（TEM）.RESULTSAmpullarycristaeormaculaofsacculeandutricleberofhaircellsincreasedandthatoflayersofsupportingcellsdecreased，acp

4、aniedbytheappearanceofneuralsynapses.Thedifferentiatedhaircellsandsupportingcellsunder，andenoninvestibularendorgansofdevelopingguineapigs.Itmaybere-latedtotheguaranteeofthenormalstructureandthefunc-tionofinnerear.　　0引言　　脊椎动物内耳发育中，有关细胞增殖、分化的研究已十分详尽，但对于细胞凋亡的报道却为数不多.鸡［1］、大鼠

5、［2］、小鼠［3］及人类［4］胚胎中，于耳泡区域发现凋亡细胞，有关细胞凋亡的功能及机制尚无定论.鉴于豚鼠内耳结构近于人耳，是内耳研究领域中重要的实验对象.目前尚未发现有关豚鼠内耳发育过程中细胞凋亡的研究资料.我们利用光镜、电镜和TUNEL技术，观察不同胚胎期豚鼠内耳前庭终器的正常发育及细胞凋亡，旨在探讨细胞凋亡在内耳发育中的意义.　　1材料和方法　　1.1材料根据雌鼠出现阴道栓及其体质量和体形变化，选择怀孕40和50d白色豚鼠.戊巴比妥纳（50mg・kg-1，ip）全身麻醉，40g・L-1多聚甲醛心脏灌注固定

6、.迅速取下胎鼠双侧听泡，挑开蜗顶及底回骨壁，去除蹬骨，自蜗尖灌注固定，置于同样固定液中，4℃冰箱8h.　　1.2方法①HE染色标本制备:将内耳标本以0.1mol・L-1B冲洗后，置于100mL・L-1EDTA，常温下脱钙12h，250g・L-1蔗糖浸泡，4℃过夜.100g・L-1明胶定向包埋，标本于Leica恒冷箱切片机，平行于蜗轴切片，厚度10μm.干燥后，切片置入Harris苏木素液染细胞核，10g・L-1盐酸乙醇分化，返蓝，5g・L-1伊红复染，切

7、片脱水，透明，光镜下观察;②TUNEL检测:采用细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士得生物工程有限公司）.ED40和ED50前庭组织切片，TBS漂洗后，新鲜配制30g・L-1H202室温处理10min;蛋白酶K（1∶100，TBS稀释）室温消化5min;标本加标记缓冲液室温10min甩掉，TdT和DIGdUTP（1∶1）加入标记缓冲液混合，加于标本上，37℃标记2h;加封闭液，室温20min;生物素化抗地高辛抗体（1∶100，封闭液稀释），37℃反应30min;SABC（1∶100，TBS稀释），37℃反应30min;DAB显色.

8、阴性对照省去TdT.每步骤间以TBS漂洗2min×3次.切片依次脱水、透明、封片;③电镜标本制备:内耳标本于显微镜下剥离壶腹，球囊斑及椭圆囊斑，置于25mL・L-1戊二醛液固定12h，10g&