胚胎期豚鼠前庭终器细胞凋亡的检测论文

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1、胚胎期豚鼠前庭终器细胞凋亡的检测论文.freel-bryonicdevelopmentAbstract:AIMThemorphologicalchangesandcellapopto-sisofvestibularorganinnormallydevelopingguineapigs-bryonicday（ED）40and50orphologicalchangesinthevestibularorganicro-scopeandapoptosisbyTdT-mediateddeoxyuridinetriphos-phate-b

2、iotinnickendlabelling（TUNEL）methodandtrans-missionelectromicroscopy（TEM）.RESULTSAmpullarycristaeormaculaofsacculeandutricleberofhaircellsincreasedandthatoflayersofsupportingcellsdecreased，acpaniedbytheappearanceofneuralsynapses.Thedifferentiatedhaircellsandsupportin

3、gcellsunder，andenoninvestibularendorgansofdevelopingguineapigs.Itmaybere-latedtotheguaranteeofthenormalstructureandthefunc-tionofinnerear.0引言脊椎动物内耳发育中，有关细胞增殖、分化的研究已十分详尽，但对于细胞凋亡的报道却为数不多.鸡［1］、大鼠［2］、小鼠［3］及人类［4］胚胎中，于耳泡区域发现凋亡细胞，有关细胞凋亡的功能及机制尚无定论.鉴于豚鼠内耳结构近于人耳，是内耳研究领域中重要的实验

4、对象.目前尚未发现有关豚鼠内耳发育过程中细胞凋亡的研究资料.我们利用光镜、电镜和TUNEL技术，观察不同胚胎期豚鼠内耳前庭终器的正常发育及细胞凋亡，旨在探讨细胞凋亡在内耳发育中的意义.1材料和方法1.1材料根据雌鼠出现阴道栓及其体质量和体形变化，选择怀孕40和50d白色豚鼠.戊巴比妥纳（50mgkg-1，ip）全身麻醉，40gL-1多聚甲醛心脏灌注固定.迅速取下胎鼠双侧听泡，挑开蜗顶及底回骨壁，去除蹬骨，自蜗尖灌注固定，置于同样固定液中，4℃冰箱8h.1.2方法①HE染色标本制备:将内耳标本以0.1molL-1B冲洗后，置于1

5、00mLL-1EDTA，常温下脱钙12h，250gL-1蔗糖浸泡，4℃过夜.100gL-1明胶定向包埋，标本于Leica恒冷箱切片机，平行于蜗轴切片，厚度10μm.干燥后，切片置入Harris苏木素液染细胞核，10gL-1盐酸乙醇分化，返蓝，5gL-1伊红复染，切片脱水，透明，光镜下观察;②TUNEL检测:采用细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士得生物工程有限公司）.ED40和ED50前庭组织切片，TBS漂洗后，新鲜配制30gL-1H202室温处理10min;蛋白酶K（1∶100，TBS稀释）室温消化5min;标本加标记缓冲液室温10

6、min甩掉，TdT和DIGdUTP（1∶1）加入标记缓冲液混合，加于标本上，37℃标记2h;加封闭液，室温20min;生物素化抗地高辛抗体（1∶100，封闭液稀释），37℃反应30min;SABC（1∶100，TBS稀释），37℃反应30min;DAB显色.阴性对照省去TdT.每步骤间以TBS漂洗2min×3次.切片依次脱水、透明、封片;③电镜标本制备:内耳标本于显微镜下剥离壶腹，球囊斑及椭圆囊斑，置于25mLL-1戊二醛液固定12h，10gL-1锇酸后固定2h，丙酮梯度脱水，丙酮及环氧树酯浸透包埋.于LKBnova型超薄切片

7、机行超薄切机行超薄切片，厚70nm.醋酸双氧铀，枸橼酸铅双染，JEM2000EX电镜观察并照相.2结果2.1光镜观察①胚胎40d豚鼠前庭终器中，可见壶腹、椭圆囊斑及球囊斑完全分化.壶腹上方为一层高柱样毛细胞，核呈圆形，体积较大，淡染;细胞质丰富，嗜酸性.下方可见二层支持细胞，胞核小，呈椭圆型，深染，紧密压集;细胞质极少.椭圆囊斑及球囊斑可见上方一层毛细胞及下方3～5层支持细胞.前者体积明显增大，胞质丰富;支持细胞内几乎看不见胞质，胞核排列紧密.毛细胞胞核较支持细胞为大，着色淡;②胚胎50d豚鼠前庭终器壶腹感觉上皮中，上方为一层

8、毛细胞及一层支持细胞，在两侧延续为双层支持细胞，下方可见神经纤维.椭圆囊斑和球囊斑感觉上皮可见一层毛细胞及二层支持细胞，结构特点同前.2.2TUNEL检测胚胎40和50d豚鼠壶腹、椭圆囊斑毛细胞和支持细胞均可见核染色为棕黄色细胞，呈强阳性细胞，即凋亡细胞（Fig1）.上方一层