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1、钒化钠对食管癌细胞系EC109Caspase：吕军姜树原邵国贾平平周立社闫少春【摘要】目的:研究钒化钠对食管癌细胞系EC109Caspase-3激活的影响,探讨钒化钠影响食管癌细胞系EC109细胞生长的机制。方法:以体外培养食管癌细胞系EC109为研究对象,给予0、0.1、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0μmol/L钒化钠,培养1小时后,用ethods:EC109esophagealcancercellsgroorthovanadatefor1houratthedoseof0,0.1,1.0,5.0,10.0,50.0,1
2、00.0,200.0μmol/Lrespectively.I1640培养基（Gibico公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），胰蛋白酶（上海华美生物工程公司），台盼兰（上海华美生物工程公司），二甲基亚砜（Amersco），聚丙烯酰胺凝胶、Caspase-3抗体、辣根酶标记山羊抗兔Ig抗体、ECL试剂盒购于北京中山公司，其他试剂均为分析纯。 1.1.3仪器二氧化碳培养箱（ThermoformaofTHEU.S.A），倒置相差显微镜（XDB-1B，国产），超净工作台（SI1640培养液中传代培养。 1.2.2SF细胞裂解液在冰上裂解细胞，
3、低温离心15分钟提取蛋白，BCA法蛋白定量。加上样缓冲液，100℃变性5分钟。每孔50μg蛋白上样，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白电转到硝酸纤维膜上,用5%脱脂奶粉封闭1小时，加一抗稀释液(1∶1000稀释)4℃过夜，TTBS洗膜，结合辣根过氧化物酶标记二抗(1∶5000稀释),TTBS洗膜，用ECL化学发光试剂在X光胶片上曝光、显影、定影。以β-actin为内参照，应用凝胶成像分析系统进行条带扫描分析结果，结果以蛋白条带的面积积分值与β-actin的面积积分值比值表示。实验重复3次。 1.2.3统计学处理采用SPSS11.0软件包对数
4、据进行单因素方差分析,统计数据以均数±标准差（x±s）表示,P<0.05为差别有统计学意义。 图1C（氧原子配位的四价金属钒配合物）通过抑制DNA拓扑异构酶发挥抗肿瘤作用，对多种肿瘤细胞株A549、Hela、BEL-7402具有明显抑制生长的作用，且可将细胞阻断在G2/M期,而对正常肝细胞生长无明显影响[4]。 肿瘤的发生、发展与凋亡有密切关系。肿瘤不仅有细胞增殖和分化的异常，亦有细胞凋亡的异常。Caspase是参与诱导细胞凋亡的重要因素，Caspase-3是哺乳类动物细胞凋亡的关键蛋白酶[5]。Caspase家族存在于哺乳动物细胞中,是
5、与线虫细胞死亡蛋白CED-3相似的一类蛋白酶,迄今已发现16个成员[6],均以无活性的前体形式存在,一经激活,将产生Caspase级联反应,导致细胞凋亡。现今认为,Caspase的激活与细胞凋亡需经两条不同的途径:一条是通过与细胞表面的死亡受体结合,激活Caspase-8后,再活化下游的Caspase(主要为Caspase-3)；另一条是各种毒性物质刺激线粒体释放的细胞色素C，激活Caspase-9后,再活化下游的Caspase(主要也是Caspase-3)[7-8]。可见这两条途径均需激活Caspase-3。近年来发现Caspase-3参与了肿瘤
6、发生过程中细胞凋亡异常的病理过程[6]，细胞凋亡的分子机制研究表明,凋亡是多基因参与的级联反应过程。其中Caspase-3是凋亡的执行器之一[9]。Caspase-3为凋亡的效应分子,是凋亡途径下游进行底物酶解的关键蛋白酶，被称为凋亡的“执行者”[10]。Caspase-3是多种凋亡途径共同作用的因子，其蛋白表达水平的高低决定着细胞凋亡程度[11]。 目前,以诱导凋亡为目标的肿瘤治疗战略主要是通过各种因子活化Caspase-3前体而实现的。本实验结果显示，不同浓度钒化钠作用食管癌细胞系EC109后1小时，低浓度钒化钠组对Caspase-3蛋白的表
7、达无明显影响，高浓度组Caspase-3蛋白的活性增加。提示一定浓度的钒化钠可能通过激活Caspase-3而发挥其促进食管癌细胞系EC109细胞凋亡的作用。这一结果为钒化钠防治食管癌的临床应用奠定理论基础。由于细胞凋亡是一个极其复杂、涉及多步骤、多因子参与的过程,故钒化钠诱导肿瘤细胞凋亡的详细机制仍需进一步研究。【参考文献】 [1]YuanJ,YanknerBA.Apoptosisinthenervoussystem[J].Nature,2000,407:802-809. [2]SternA,YinX,TsangSS,etal.Vanadium
8、asamodulatorofcellularregulatorycascadesandoncogeneexpression
