黑曲霉cbh1基因和耐高糖bgl1基因克隆表达及定向改造

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1、黑曲霉cbh1基因和耐高糖bgl1基因克隆表达及定向改造第一章绪论1.1纤维素酶的概述纤维素酶不是单一酶，而是一类能够将纤维素降解为葡糖糖的多组分复合酶系[2]，现已确定纤维素酶含有三种主要组分：(1)外切型-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.91)：也称C1酶、纤维二糖水解酶或CBH。C1酶是纤维素酶系中的重要组分，在天然纤维素的降解过程中起主导作用，它能从纤维素链的非还原性末端切割，生成可溶的纤维糊精和纤维二糖。(2)内切型-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)：也称Cx酶或EG。它能水解溶解的纤维素衍生物或者膨胀和

2、部分降解的纤维素，但不能作用于结晶的纤维素。它以随机的形式在纤维素聚合物内部的非结晶区进行切割，对末端键的敏感性比间键小，主要产物是纤维糊精、纤维二糖和纤维三糖。(3)β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)：也称CB、纤维二糖酶或BG。它能水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快，随着葡萄糖聚合度的增加水解速度下降。纤维素酶系可分为完全酶系和不完全酶系，其中能够降解无定性纤维素和结晶纤维素的酶系称为完全酶系或全值酶系，仅能降解无定性纤维素的酶系称为不完全酶系或低值酶系，不同种类的微生物所形成的纤

3、维素酶系之间在组分的种类和性质上均有很大差异[3]。纤维素酶的广泛，昆虫、原生动物、细菌、放线菌和真菌等都能产生纤维素酶[4]。微生物是纤维素酶的最主要，包括细菌、真菌和放线菌等。目前研究较多的是真菌和细菌，对放线菌研究的相对较少，细菌产生的纤维素酶的量较少，主要为内切酶，且多数不能分泌到胞外，而真菌所产的纤维素酶具有酶谱较全、活力较高的特点且一般分泌到胞外。1.1.2纤维素酶的结构特征纤维素酶一般具有两个结构域：一个是具有催化功能的催化域(catalyticdomain，CD)，它是最大的功能区，体现了酶的催化活性，虽然酶分子大小有

4、所不同，但它们的催化区大小却一致；另一个是具有独立功能的酶作用底物区域，它有2个主要的区：多糖结合区（chitin-bindingdomains）和纤维素结合区（cellulose-bindingdomainsCBDs）[6-7]，这些区域能够通过一种机制影响不溶解底物的水解率，但人们对这种机制还不清楚。经鉴定CBD还有2个主要的亚型，一个是真菌酶[8]，由33～36个氨基酸组成，且具有高度的同源性；另一个是细菌酶[9]，由100~110个氨基酸组成，同源性较低。在2个独立活性的结构域间有一段柔性的多链接区称为连接桥，真菌连接桥一般富

5、含Gly、Ser和Thr，而细菌则完全由Pro-Thr这样的重复顺序组成。另外在分子形状上，真菌酶催化功能的催化域、连接桥和纤维素结合区呈直线连接，而细菌酶催化域、连接桥和纤维素结合区之间呈135[10]。。由于纤维素全酶分子呈蝌蚪状、其linker高度糖基化且具有较强柔韧性，故很难得到结晶，而结构域的拆分使呈球形催化域的结晶成为可能，为纤维素酶的结构和功能研究开辟了蹊径[11]。Tormo用光衍射的方法对不同纤维素酶CBD的三维结构进行了研究。比较发现：尽管它们在分子大小和折叠构型上不同，但它们的吸附面是相似的，都比较平坦，暴露出几

6、个芳香族氨基酸及一些潜在的氢键形成的残基。CBD的主要功能是将酶分子连接到纤维素上。研究表明，这种一面亲水，一面疏水的楔形结构，使它能插入和分开纤维素的结晶区，在其吸附于纤维素分子链表面后，具有疏解纤维素链的作用。研究还表明芳香族氨基酸在与结晶纤维素的吸附中发挥重要作用，它们的突变会导致CBD对结晶纤维素的吸附能力极剧下降[12]。目前人们推测，可能通过芳香环与葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素上，由CBD上其余的氢键形成残基与相邻葡萄糖链形成氢键将单个葡萄糖链从纤维素表面疏解下来，以利于催化区的水解作用[13]。1.1.3纤维素酶的作用机

7、理纤维素酶使纤维素转化成葡萄糖的机理和详细过程至今仍不十分清楚，但是被普遍接受的理论主要有3种：协同理论（Synergism）、原初反应假说（Initialdegrading）和碎片理论（Fragmentation），其中以协同理论最为广泛接受[14]。该理论认为是内切葡萄糖酶首先进攻纤维素的非结晶区，形成外切纤维素酶需要的新的游离末端，然后外切纤维素酶从多糖链的非还原端切下纤维二糖单位，β-葡萄糖苷酶再水解纤维二糖单位形成葡萄糖，一般来说协同作用与酶解底物的结晶度成正比，当酶组分的混合比例与霉菌发酵滤液各组分相近时，协同作

8、用最明显。协同作用是纤维素酶系的最重要的特征之一，并且这种协同作用比较复杂，不仅内切外切酶之间具有协同作用，不同的外切酶及不同的内切酶之间也有协同作用。不仅酶系中各组分存在协同作用，酶与其他物质或微生物间亦存在较强烈的协