肺癌组织细胞fhit基因启动子甲基化和转录表达

《肺癌组织细胞fhit基因启动子甲基化和转录表达 》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、肺癌组织细胞FHIT基因启动子甲基化和转录表达余宗涛，袁亚莉，张吉才，高琼，王元元【摘要】目的探讨FHIT(fragilehistidinetriad,脆性组氨酸三联体)基因表达水平及其启动子CpG岛甲基化状态与肺癌发生发展的关系。方法用实时定量PCR检测FHITmRNA在肺癌组织、肺癌旁组织与去甲基化剂5氮杂2’脱氧胞苷（5Aza2’deoxycytidine、5AzaCdR）处理前后A549细胞株中的表达，用甲基化特异性PCR（MSPCR）检测FHIT启动子CpG岛甲基化状态。结果FHITmRNA在肺癌旁组织中全部表达，在肺癌组织中表达缺失率为48.8

2、9%（22/45），且表达量低于正常肺组织（t=-15.851，Ｐ0.001），但在不同年龄和性别、肿瘤大小、恶性程度、肿瘤分类的差异无显著性；FHIT基因启动子在肺癌组织中发生甲基化的频率为40%(18/45)、在癌旁组织中频率8.7%(2/23)（χ2=7.184,Ｐ0.01），18份启动子区甲基化的肺癌标本中，10份同时伴有mRNA表达缺失。结论在肺癌组织中，FHIT基因启动子甲基化频率明显升高，其表达缺失或下调，提示FHIT启动子甲基化可在肺癌发生和发展中起一定作用。【关键词】肺癌；CpG岛甲基化；MSPCR；FHIT基因1资料与方法1.1资料1.1.1标本来源收

3、集湖北省十堰市太和医院2005年3月～2006年2月手术切除肺癌新鲜标本45例，男28例、女17例。小细胞肺癌（SCLC）8例、非小细胞肺癌（NSCLC）37例。全部标本均经病理证实。连同23例距离肿瘤边缘2cm外正常对照组织。-80℃冰箱保存备用。1.1.2A549细胞株培养及药物处理将对数生长期A549细胞制成5×104/ml细胞悬液，5%CO2条件下培养24h后，分别用5×10-6mol/L和5×10-5mol/L浓度5AzaCdR处理，24h后弃去药液并重新更换含新鲜培养液的药液，浓度同前，连续作用3d后弃去药液，用完全培养液继续培养4d后进行实验，用同体积PB

4、S处理的细胞作为对照组。1.1.3主要试剂及及仪器SPCR磺化修饰后的基因组DNA50～100ng(3μl)，10×buffer3μl，2mmol/LdNTP3μl，25mmol/L氯化镁3μl，Taq酶2U(1μl)，上下游引物各2μl(12pmol)，20×SYBRGreenⅠ0.75μl，去离子水补齐至30μl。置PE7000仪进行扩增：95℃变性3min，(95℃×60s,58℃×30s,72℃×60s)×40，在72℃读取荧光值，最后一个循环72℃延伸5min。1.2.5RTPCR用无RNA酶的双蒸水稀释cDNA至100μl，PCR反应体系及循环参数同MSP

5、CR。1.2.6FHITmRNA相对定量方法利用检测得到的Ct值和计算得到的扩增效率，以GAPDHmRNA的量为参照，计算FHITmRNA的相对量。FHITmRNA/GAPDHmRNA用下述公式计算：(1+EGAPDH)Ct(GAPDH)/(1+EFHIT)Ct(FHIT)[7]。1.2.7统计学分析用SPSS10.0软件分析，mRNA表达水平定量测定用t检验，启动子甲基化状况用卡方检验。2结果2.1MSPCR检测结果肺癌基因组DNA标本中，有10例（其中SCLC3例）只存在甲基化PCR产物，另外35例标本中都存在非甲基化PCR产物，其中既有甲基化又有非甲基化产物的8例

6、（其中SCLC1例）；而在23例正常对照组织中，存在甲基化2例，且均可检测出非甲基化产物的存在，两者之间差异有统计学意义，见表1；在年龄、性别、分化程度、肿瘤的病理类型、肿瘤大小差异无统计学意义（P>0.05）。表１FHIT甲基化化状况及mRNA相对定量组织病例注：①χ检验：χ2=7.184、P0.01；②两独立样本t检验：t=-15.851、P0.0012.2靶基因FHITmRNA的相对定量癌旁组织中，FHITmRNA相对定量在0.85±0.11，而在检出甲基化的18例肺癌组织中，10例FHITmRNA低于检测下限；在肺癌标本中FHITmRNA的相对定量在0.24±

7、0.20，差异显著；在A549细胞株中，FHITmRNA测定比值为0.56，但用5AzaCdR处理后，其FHITmRNA测定比值为0.97。2.3PCR产物分析经2%琼脂糖凝胶电泳证实了是一条特异的目的带,见图1~3。图1MSPCR检测肺癌中FHIT基因甲基化状态电泳图M=74bp，U=74bp图2管家基因GAPDH(226bp)内对照电泳图M：甲基化；U：未甲基化；Darker：分子量标准图3FHITmRNA(532bp)RTPCR电泳图3讨论我们实验组用SYBRGreenⅠ实时定量PCR测定FHITm