肺癌患者PTEN基因启动子甲基化和转录表达的研究

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1、肺癌患者PTEN基因启动子甲基化和转录表达的研究作者：余宗涛高琼张吉才吕军袁亚莉【摘要】目的探讨张力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)启动子CpG岛甲基化状态和基因表达水平与肺癌发生的关系。方法用甲基化特异性PCR检测PTEN启动子CpG岛甲基化状态，实时定量PCR检测PTENmRNA的表达水平。结果在肺癌组织中PTEN基因启动子甲基化的频率为%(12/45)，在肺正常组织中未发生甲基化(χ2=,P);PTEN甲基化与其mRNA表达下降密切相关。结论肺癌中PTEN基因启动子甲基化频率明显升高，其表达普遍下调或缺失，提示PTEN启动子甲基可

2、在肺癌发生、发展中起一定作用。【关键词】肺癌;PTEN基因;启动子;甲基化;表达PTEN位于染色体10q2313，含有9个外显子和8个内含子。PTEN蛋白是由403个氨基酸组成的一条多肽链，其主要结构功能区位于N端，在第122～13位的氨基酸序列(IHCKAGKGRTG)符合蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPase)及双特异性磷酸酶催化区的核心基序(HCXXGXGRXG)是至今为止发现的第1个具有磷酸酶活性的抑癌基因〔1〕。PTPase可使蛋白质中的酪氨酸残基去磷酸，此作用恰好与许多癌基因产物酪氨酸蛋白激酶(TPK)的作用相反。而酪氨酸在TPK

3、的参与下被磷酸化，在调控细胞生长、分化和癌变方面起重要作用。PTEN在正常组织中均有广泛表达，但在许多肿瘤组织(如肝癌)中却都有着很高的缺失率或低表达。目前随着表观遗传学研究的发展，抑癌基因启动子区CpG岛的高甲基化已被当作引起转录沉默的普遍机制〔2〕。本研究应用逆转录实时定量PCR方法测定PTENmRNA在肺癌组织、肺正常组织及肿瘤细胞株A549中的表达，以及在A549细胞株采用5AzaCdR处理后PTENmRNA的表达水平变化，同时观察其启动子甲基化状态，分析基因表达水平与启动子甲基化和肺癌早期诊断、恶性转移及预后评估等的临床关

4、系。　1材料与方法材料标本来源收集湖北省十堰市太和医院005年3月至XX年2月手术切除肺癌新鲜标本4例，男2例，女17例。年龄45～7岁，平均岁。其中小细胞肺癌(SLLC)8例、非小细胞肺癌(NSCLC)37例，全部标本均经病理证实，连同2例非癌症肺正常对照组织，-80℃冰箱保存备用。细胞株培养及药物处理将对数生长期A549细胞制成5×104/ml细胞悬液，5%CO2条件下培养2h后，分别用5×10-6mol/L和5×10-5mol/L浓度5AzaCdR处理，2h后弃去药液并重新更换含新鲜培养液的药液，浓度同前。连续作用d后弃去药液

5、，用完全培养液继续培养d后进行实验。用同体积PBS处理的细胞作为对照组。主要试剂与仪器WizardDNAcleanup纯化试剂盒、ReverseTranscriptionSystemA3500、TrizolReagent(美国Promega公司);PCR试剂(华美公司);RPMI1640培养基(GIBCOBRL公司);二甲亚砜(DMSO)、对苯二酚和亚硫酸氢钠、5AzaCdR(美国Sigma公司);人肺癌细胞株A549(武汉大学生物保藏中心);PE7000(美国ABI公司)。引物合成PTEN甲基化引物〔3〕：5′TTTTTTTTC

6、GGTTTTTCGAGGC3′，5′CAATCGCGTCCCAACGCCG3′，扩增片段长度为13bp。PTEN非甲基化引物〔3〕：5′TTTTGAGGTGTTTGGGTTTTTGGT3′，5′ACACAATCACATCCCAACACCA3′，片段长度为12bp;PTENmRNA引物〔4〕：5′AACCCACCACAGCTAGAACT3′，5′ATACACATAGCGCCTCTGAC3′，片段长度为251bp。GAPDHmRNA引物〔5〕：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′，5′GAAGATG

7、GTGATGGGATTTC3′，扩增片段长度为22bp(北京赛百盛公司)。1.方法组织、细胞DNA提取以经典酚氯仿抽提法提取组织DNA，经紫外260nm定量后于-80℃保存备用。组织、细胞RNA提取后立即逆转为cDNA按Trizol操作说明书提取组织及细胞RNA，提取后溶于无RNA酶的双蒸水中，立即用试剂盒A3500逆转为cDNA，-40℃保存备用。基因组DNA的磺化修饰基因组DNA的磺化修饰参照文献〔6〕：取μg(总体积为50μl)基因组DNA，经变性、碱基修饰、脱盐后回收再脱去磺化基团，用预冷酒精沉淀回收。离心干燥后重新溶于50

8、μl去离子水中，置-40℃备用。甲基化特异性聚合酶链反应(MSPCR)PCR反应体系：磺化修饰后的基因组DNA0～100ng(μl)，10×bufferμl，mmol/LdNTPμl，2mmol/L氯化镁