肺癌患者pten基因启动子甲基化和转录表达的研究

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1、肺癌患者PTEN基因启动子甲基化和转录表达的研究作者：余宗涛高琼张吉才吕军袁亚莉【摘要】目的探讨张力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)启动子CpG岛甲基化状态和基因表达水平与肺癌发生的关系。方法用甲基化特异性PCR检测PTEN启动子CpG岛甲基化状态，实时定量PCR检测PTENmRNA的表达水平。结果在肺癌组织中PTEN基因启动子甲基化的频率为26.67%(12/45)，在肺正常组织中未发生甲基化(χ2=7.448,P<0.01)。正常组织中PTENmRNA全部表达，肺癌组织中表达缺失率为22.22%(10/45)，且表达量低于正常肺组织(t=-14.15

2、6,P<0.001)，不同年龄、性别、肿瘤大小、恶性程度、肿瘤分类中其表达量无显著性差异(P>0.05);PTEN甲基化与其mRNA表达下降密切相关。结论肺癌中PTEN基因启动子甲基化频率明显升高，其表达普遍下调或缺失，提示PTEN启动子甲基可在肺癌发生、发展中起一定作用。【关键词】肺癌;PTEN基因;启动子;甲基化;表达PTEN位于染色体10q2313，含有9个外显子和8个内含子。PTEN蛋白是由403个氨基酸组成的一条多肽链，其主要结构功能区位于N端，在第122～133位的氨基酸序列(IHCKAGKGRTG)符合蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPase)

3、及双特异性磷酸酶催化区的核心基序(HCXXGXGRXG)是至今为止发现的第1个具有磷酸酶活性的抑癌基因〔1〕。PTPase可使蛋白质中的酪氨酸残基去磷酸，此作用恰好与许多癌基因产物酪氨酸蛋白激酶(TPK)的作用相反。而酪氨酸在TPK的参与下被磷酸化，在调控细胞生长、分化和癌变方面起重要作用。PTEN在正常组织中均有广泛表达，但在许多肿瘤组织(如肝癌)中却都有着很高的缺失率或低表达。目前随着表观遗传学研究的发展，抑癌基因启动子区CpG岛的高甲基化已被当作引起转录沉默的普遍机制〔2〕。本研究应用逆转录实时定量PCR方法测定PTENmRNA在肺癌组织、肺正常组织及

4、肿瘤细胞株A549中的表达，以及在A549细胞株采用5AzaCdR处理后PTENmRNA的表达水平变化，同时观察其启动子甲基化状态，分析基因表达水平与启动子甲基化和肺癌早期诊断、恶性转移及预后评估等的临床关系。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1标本来源收集湖北省十堰市太和医院2005年3月至2006年2月手术切除肺癌新鲜标本45例，男28例，女17例。年龄45～78岁，平均55.3岁。其中小细胞肺癌(SLLC)8例、非小细胞肺癌(NSCLC)37例，全部标本均经病理证实，连同23例非癌症肺正常对照组织，-80℃冰箱保存备用。　　1.1.2A549

5、细胞株培养及药物处理将对数生长期A549细胞制成5×104/ml细胞悬液，5%CO2条件下培养24h后，分别用5×10-6mol/L和5×10-5mol/L浓度5AzaCdR处理，24h后弃去药液并重新更换含新鲜培养液的药液，浓度同前。连续作用3d后弃去药液，用完全培养液继续培养4d后进行实验。用同体积PBS处理的细胞作为对照组。　　1.1.3主要试剂与仪器I1640培养基(GIBCOBRL公司);二甲亚砜(DMSO)、对苯二酚和亚硫酸氢钠、5AzaCdR(美国Sigma公司);人肺癌细胞株A549(武汉大学生物保藏中心);PE7000(美国ABI公司

6、)。　　1.1.4引物合成PTEN甲基化引物〔3〕：5′TTTTTTTTCGGTTTTTCGAGGC3′，5′CAATCGCGTCCCAACGCCG3′，扩增片段长度为134bp。PTEN非甲基化引物〔3〕：5′TTTTGAGGTGTTTGGGTTTTTGGT3′，5′ACACAATCACATCCCAACACCA3′，片段长度为124bp;PTENmRNA引物〔4〕：5′AACCCACCACAGCTAGAACT3′，5′ATACACATAGCGCCTCTGAC3′，片段长度为251bp。GAPDHmRNA引物〔5〕：5′GAAGG

7、TGAAGGTCGGAGTC3′，5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′，扩增片段长度为226bp(北京赛百盛公司)。　　1.2方法　　1.2.1组织、细胞DNA提取以经典酚氯仿抽提法提取组织DNA，经紫外260nm定量后于-80℃保存备用。　　1.2.2组织、细胞RNA提取后立即逆转为cDNA按Trizol操作说明书提取组织及细胞RNA，提取后溶于无RNA酶的双蒸水中，立即用试剂盒A3500逆转为cDNA，-40℃保存备用。　　1.2.3基因组DNA的磺化修饰基因组DNA的磺化修饰参照　　2结果　　2.1PTEN甲基化结果在全部45例经亚硫

8、酸氢钠处理的基因组DNA标本中，有5例