实体肿瘤干细胞分离鉴定技术的研究进展

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1、实体肿瘤干细胞分离鉴定技术的研究进展【关键词】肿瘤干细胞分离鉴定技术方法　　肿瘤干细胞（CancerStemCell,CSC）是目前肿瘤研究中的热点问题。依照肿瘤干细胞观点，肿瘤细胞呈异质性，少数的CSC决定了肿瘤的形成、复发及转移，这无疑是对传统的肿瘤治疗形成很大的冲击，因此也是目前争议很大的问题。1997年第一次分离出肿瘤干细胞-血液系统急性髓样白血病肿瘤干细胞，随后实体肿瘤中肿瘤干细胞的研究也逐步开展，已从人脑肿瘤、乳腺癌、肝癌、肾癌等患者的癌组织及细胞系中成功分离、鉴定了肿瘤干细胞。可见为弄清楚CSC的本质，首当其冲的任务是将肿瘤组织及细胞系中

2、的CSC分离、纯化并进行鉴定。现结合文献资料将各种分离鉴定方法总结如下，以便对CSC更好地进行研究。　　1肿瘤干细胞的分选方法　　目前文献中分离CSC的方法主要有利用肿瘤干细胞细胞表面标志物（cell-surfacemarker）的分选及根据其生物学特性进行的功能分选两大类。　　1.1利用细胞表面标志物分选目前发现的肿瘤干细胞多是利用marker分选发现的。实体瘤CSC18的标志物及分离鉴定方法均借助了正常干细胞的研究，干细胞的严格鉴定和分离也仅在极少的组织中完成，许多实体组织自身的干细胞表面标志物尚未确定。因此对CSC的表型分离鉴定还仅限于少数实体肿

3、瘤。分离出的带有此标志物的细胞往往是正常组织干细胞也具有的。因此，这就涉及到SC与CSC之间的差别。这方面的进展还只是起步阶段。有学者认为，既然肿瘤干细胞属于未分化细胞，那其表面的标志物应当很少甚至没有。一旦细胞具有了表面标志，就不能再称其为“干细胞”。据此认为目前根据marker分离出的应该属于肿瘤干细胞下一个级别的细胞——肿瘤起始细胞。尽管各家对CSC的定义、阶段及分化时间有异议，但一致公认根据marker分离出的目的细胞往往处于决定细胞分化方向的重要阶段，这部分细胞对对肿瘤的形成发展、放化疗抵抗，术后及放、化疗后复发非常重要。因此对这一特殊细胞亚

4、群的研究将对肿瘤研究有极大推动。Marker的确定是很困难的事情，对肿瘤干细胞marker的研究多沿用干细胞的marker，CD133标记分子在目前CSC研究中应用较多。　　利用marker分选的原理是：假定某抗原分子阳性或阴性的细胞为该肿瘤细胞中的CSC，以相应抗体与抗原结合（预先以一抗与细胞表面分子结合，再以二抗与之结合），再经特定仪器和设备将阳性与阴性细胞分离开来得到目的细胞。目前常用的有荧光激活细胞分选(Fluorescenceactivatedcellssorting,FACS）和磁性激活细胞分选(Magneticactivatedcells

5、sorting,MACS）。18　　细胞亲和板结合分离法也是利用抗原抗体反应，将具有某种抗原标志的细胞结合到平皿上，从而与悬浮细胞中的阴性细胞分离。有些学者利用这种方法来分离肿瘤干细胞。　　1.1.1磁性激活细胞分选(MACS)磁性激活细胞分选术(MACS）是高效简捷的免疫细胞及其它细胞的分离纯化方法，因其应用免疫磁珠来进行分选，故又称免疫磁珠分选。原理是已包被一抗的磁珠与细胞表面相应分子特异性结合（直标），或者已包被二抗(羊抗小鼠或羊抗大鼠)的磁珠与预先已与细胞表面分子特异结合的一抗结合（间标）。让标记好的细胞经过置于磁场的分离柱，磁珠携带与之结合的

6、细胞吸附于分离柱内面，未结合细胞则经分离柱流下。再经洗涤，实现阳性细胞分离或阴性细胞的分离，从而纯化CSC。若加以相应荧光抗体，则利用流式细胞仪来评价MACS的分选效率。　　目前报导经MACS成功分选肿瘤干细胞的文献较多，例如以CD133免疫磁珠分选喉癌Hep-2细胞系中CSC［1］，关于MACS分选效率报导不一。原代分离的效率在46.9%～79.8%［2］。分选脐血单个核细胞，CD133表达率为86.04%。有学者从人胎脑中分离纯化CD133细胞，分选后所得细胞纯度为85.57％，回收率为62.3%［3］；CD133免疫磁珠分选喉癌Hep-2细胞的分

7、选效率达90.26%。考虑可能原因为所分选的细胞不同或所用的仪器不同，或为分选率和细胞得率的区别。18　　免疫磁珠分选纯度比流式低，不过对细胞活性影响小。磁珠直径仅50nm，体积约小于真核细胞的百万分之一，不会对细胞造成机械性压力；其组分多为氧化铁和多糖，可被生物降解，因此不影响细胞的生理功能及活力［4］；分选过程无菌，便于后续培养。如果marker已知，免疫磁珠法有很大的优越性。　　MACS在实际应用中也受到以下因素的限制：分选前的细胞收集、处理过程耗时较长；分选设备及磁珠价格昂贵；分选柱的容积限制了分选细胞的数量。为后续实验工作带来了一定的限制。　

8、　1.1.2荧光激活细胞分选（FACS）荧光激活细胞分选（Fluorescenceactiva