plfa 测定操作规程(修改)

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1、PLFA测定操作规程仪器设备：名称规格数量用途烘箱**1测定土壤含水量冷柜4℃1暂存土壤样品冷柜-20℃1用于土壤样品的长期保存及2-3天内待检测样品的保存冷柜-80℃1保存3天以上的待检测样品通风橱中1试验各步骤均需在通风橱中进行分析天平1/100001称样及测定含水量振荡器可调速1提取超速离心机最高转速〉5000r/min1提取氮吹仪DC-121浓缩提取液萃取收集器12孔SUPELCOVISIPREPTMDL1纯化（获取PLFA）真空泵10-30Pa25L/min1加速淋洗速度水浴锅恒温1甲醇分解微量加样枪200ul1移液微量加样枪50

2、0ul1移液微量加样枪1000ul1移液微量加样枪5000ul1移液移液瓶6ml1移液移液瓶12ml2移液移液瓶23ml1移液实验耗材:名称规格数量用途铝盒中号24测定含水量离心管50ml24提取分液漏斗250ml24萃取样品溶液的酯类物质大试管A35ml24盛装分液漏斗分离的总酯提取液大试管B10ml24盛装经萃取小柱分离的PLFA甲醇溶液大试管C5ml24盛装甲醇分解后的PLFA甲酯溶液萃取小柱3mlor6ml24纯化PLFA枪头5ml10移液枪头1ml5移液枪头500ul30移液枪头200ul60移液丙腈橡胶手套中号2实验操作时须戴橡

3、胶手套厚2清洗容器时须戴纱布卷1罩容器试剂瓶时用注：数量以24个样品计。实验试剂（以24个样品计）：名称规格最低用量正己烷分析纯120ml三氯甲烷分析纯840ml甲醇优级纯720ml丙酮优级纯240ml甲苯优级纯12ml氢氧化钾优级纯24ml0.2MKOH醋酸优级纯7.2ml1MCH3COOH磷酸优级纯530ml超纯水48ml注：未计清洗用量和配试剂用量。试剂:1、磷酸缓冲液[c(K2HPO4)=0.05mol·L-1]：38.84gK2HPO4加入12mlCHCL3再加入超纯水稀释到4000；2、提取液[v（甲醇）：v（三氯甲烷）：v（磷

4、酸缓冲液）=2：1：0.8]：526mlCH3OH加入263mlCHCL3再加入210ml磷酸缓冲液；3、甲醇甲苯混合液[v（甲醇）：v（甲苯）：=1：1]：取100ml甲醇和100ml甲苯混合；4、甲基化醋酸[c(CH3COOH)=1mol·L-1]：4.60mlCH3COOH加入80ml超纯水；5、甲基化氢氧化钾[c(KOH)=0.2mol·L-1]：28.05gKOH溶解于1000ml超纯水中为0.5MKOH溶液，再取40ml0.5MKOH溶液加入60mlCH3OH为0.2MKOH溶液。PLFA提取操作流程：实验前准备工作1、土壤过2

5、mm筛，用镊子捡出根、凋落物碎屑及小石块；2、20克左右土壤样品置于铝盒中，称盒+鲜土重105烘干，称盒+干土重计算土壤含水量；3、配制试剂，准备实验用品。注意：所有玻璃器皿（试管、小瓶及瓶盖等）在实验前均须用正己烷清洗，晾干。实验操作时必须戴丙腈橡胶手套。实验第一天称取相当于8g干重的土壤，置于35ml离心管中向离心管中加入5ml磷酸缓冲液（用5ml移液枪，将含水量计入），再加入6ml三氯甲烷，12ml甲醇（用移液瓶）振荡2小时上层离心液倒入分液漏斗加12ml三氯甲烷，12ml磷酸缓冲液于分液漏斗中25℃，3500rpm,离心10分钟加入

6、23ml提取液于离心管中的剩余土壤中，手工摇动上层离心液倒入分液漏斗振荡30分钟摇动2分钟，静置过夜下层加水，摇动，丢弃多余土壤，用清洗剂洗刷离心管25℃，3500rpm,离心10分钟实验第二天将分液漏斗中下层溶液放入大试管A中加3ml三氯甲烷调节萃取小柱（5ml移液枪）30-32℃水浴，N2浓缩弃去5份200微升三氯甲烷转移浓缩磷脂到萃取小柱（用250或500微升移液枪，第1-2次转移时直接从试管底部吸取，第3-5次转移时则在转移前用移液枪冲洗试管内壁。向萃取小柱加入5ml三氯甲烷加2次5ml丙酮甲醇清洗萃取小柱底部加5ml甲醇，大试管B

7、收集淋洗液32℃水浴，N2浓缩加1ml1:1甲醇：甲苯，1ml0.2M氢氧化钾溶液，摇匀37℃水浴加热15分钟加0.3ml1M醋酸溶液，2ml己烷，2ml超纯水低速振荡10分钟下层加2ml己烷，再振荡10分钟上层己烷溶液移入小瓶上层己烷移入小瓶转入色谱仪专用的内衬管，2-3天内检测2-3天-20℃保存，超过3天-80℃保存用移液枪加2次100微升己烷于干燥样品中，摇动N2脱水干燥，不用水浴（如果3-4天内不上色谱检测则到此为止）注意事项ａ．所有实验用品应为玻璃或氟塑料（PTFE,聚四氟乙烯），并且无脂。实验器材要用热水和无磷洗洁剂清洗。用流

8、动水冲洗掉泡沫后再冲洗５次，再用去离子水冲洗10次，风干。使用前用化学纯（reagentgrade）氯仿冲洗；或在上述冲洗风干后在450℃下烘干4~5小时。严格地说实验器材应避免