凋落物PLFA取样和处理方法.doc

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1、凋落物和土壤前处理取样：每个次小区分别取1袋米老排凋落物和1袋杉木凋落物，每个网袋单独装入一个塑料袋；同时用土钻取网袋下面0-10cm土壤装入自封袋。共36个网袋+36个土样。网袋和土壤放在装有冰块的冰盒带回实验室。凋落物前处理：1，混合：凋落物带回实验室后，用剪刀剪碎混合，分成三份，一份-20℃冷藏做PLFA，一份4℃保鲜做凋落物酶，另一份烘干称重计算分解速率。2，脱水：把-20℃冷藏的凋落物放入冷冻干燥机脱水（-80℃），24小时左右3，粉碎：脱水之后的凋落物用球磨机粉碎，装入自封袋，封好袋口，-20℃冷冻。4，运输：把凋落物

2、和土壤样品装入放有冰块的大冰盒带到广州。5，实验时每个样品用量为0.1g（华南植物园），其他程序与土壤PLFA一样。土壤前处理：带回实验室的土壤人工挑拣出石子，细根等，然后混合放在-20℃冷冻带到广州。具体实验步骤：1、凋落物样品用球磨机粉碎（<10μm）2、称取冷冻干燥后的凋落物样品（250±1mg）于玻璃离心管中（25ml），用磷酸钾溶液（50mmoll-1,pH7.4）1.6ml、甲醇4ml、氯仿2ml；3、涡旋30s，超声2min，在37℃下温育30min，然后离心（800×g），将上层清液倒入50ml分液漏斗中。然后再重

3、复浸提一次，合并两次上层清液。4、向分液漏斗中再加入4ml氯仿，4ml水，然后轻轻的摇匀，放置整晚。第二天5、收集分液漏斗中的下层清液（氯仿相），在氮气下吹干。6、通过色谱硅胶小柱进行脂质分离：用氯仿（3×2ml）洗脱中性脂质，用丙酮（3×2ml）洗脱糖脂，这些全部丢弃。最后用甲醇（3×2ml）洗脱极性脂类，收集到玻璃试管中。在氮气下吹干。7、在剩余残留物中，加入2ml氢氧化钾（KOH），1ml甲苯：甲醇（1：1，v/v），然后在37℃下温育30min。参考文献：Priortoanalysis,frozensampleswereg

4、roundwithaWileyMilltopassthrougha40-meshscreen.(From:Temporaldynamicsofmicrobialcommunitiesondecomposingleaflitterof10plantspeciesinrelationtodecompositionrate:SBB)SubsamplesforPLFAandenzymeassayswerefrozen(-20C)untilanalysis.(From:SARAHE.HOBBIE)LFAswereextractedfrom0

5、.5gfreeze-driedresidues(PetraMarschner;SBB)