plfa方法改良-07072009

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1、土壤微生物磷脂脂肪酸（PLFA）提取和分离步骤试剂：（每1土壤样品所需用量）1甲醇:氯仿:磷酸缓冲液=2:1:0.8（1×30ml）2磷酸缓冲液=磷酸二氢钾:磷酸氢二钾:蒸馏水=1.36g:1.74g:400ml,用NaOH调pH7.4,提取液配置时先加磷酸缓冲液和甲醇，再加氯仿3氯仿(1×2.5ml+10ml)4无菌水(1×2.5ml)5硅酸(100-200mesh,1×0.5g)6丙酮（1×10ml）7甲醇（1×6ml）8100μl-50mg/l的内标样十九烷酸nonadecanoicacid(19:0)9试剂1（NaOH

2、:甲醇:蒸馏水=45g:150ml:150ml）（1×1ml）10试剂2（6NHCl:甲醇=325ml:275ml）（1×2ml）11试剂3（正己烷:甲基叔丁醚=200ml:200ml）（1×9ml）12试剂41.2%(w/v)NaOH（1×3ml）仪器和耗材：1离心管2漩涡振荡3复式振荡机4离心机5收集管6玻璃移液管（15、10、5、1、0.1ml）7冰箱8电热干浴9硅酸柱10玻璃棉11铝箔12通风柜13真空干燥器14PLFA接受试管15氮气和氮吹仪16水浴锅17滴管18GC小瓶19试管架20棕色玻璃试剂瓶提取步骤：1.称取

3、2g冷冻干燥后土样于离心管中（可称2~5克，有机质含量越高，称取质量越少）。2.加入15ml提取液（甲醇:氯仿:磷酸缓冲液=2:1:0.8，磷酸缓冲液=KH2PO4:K2HPO4:蒸馏水=1.36g:1.74g:400ml,用NaOH调pH7.4,提取液配置时先加磷酸缓冲液和甲醇，再加氯仿），漩涡振荡1min，然后室温下往复式振荡16h（室温下水平振荡），静止10min。3.室温下1000—1500rpm离心10mins，上清液用移液管转入收集管中。4.再加15ml提取液于离心管中，漩涡震荡1min，然后往复式振荡2h，静止1

4、0min。5.室温下同样速度再离心10min，上清液转移到收集管中，两次合并。6.将此收集管中加入2.5ml氯仿和2.5ml无菌水，振荡1min，放入4℃冷藏冰箱静止过夜，将下层转入另一收集管中，在40℃电热干浴用氮气吹干，用1ml氯仿溶出，在-20℃冰箱里保存。7.硅酸柱编号（一般是无法编号的，因为有机溶剂会将它们洗去。一般用有编号的样品试管一一对应）。8.柱子下颈部塞入适量玻璃棉，加入适量（0.5克左右5-8cm高）硅酸(Silicicacid,100-200mesh)，硅酸柱直立浸入氯仿中，氯仿高度与硅酸高度相平，用铝箔

5、覆盖，在通风柜中过夜。然后，放在真空干燥器中抽真空赶气泡（约3-5分钟），使柱体保持氯仿浸润。9.在柱顶逐渐加入氯仿提取样品，保持柱子硅酸表面湿润(不能发白)，样品加完后，用少量氯仿洗样品试管三次，然后用5ml氯仿淋洗柱子；10.再用10ml丙酮淋洗柱子，洗完后让丙酮液滴滴尽，将PLFA接受试管(编号)接在柱子下，用5ml甲醇洗脱PLFA；11.在甲醇洗脱液中加入100μl-50mg/l的内标样十九烷酸（19:0），在40℃电热干浴用氮气吹干，用1ml甲醇溶出；12.皂化：加入1ml试剂1（NaOH:甲醇:蒸馏水=45g:15

6、0ml:150ml），拧紧盖子，涡旋振荡5-10s，松开盖子一圈，置沸水浴5min，然后拧紧盖子，涡旋振荡5-10s后再置于沸水浴中25min，取出后用冰浴退火；13.甲基化：加入2ml试剂2（6NHCl:甲醇=325ml:275ml），盖紧盖子，涡旋振荡，于80˚C±1˚C加热保温10min±1min，取出后用冰浴？退火；14.萃取：加入3ml试剂3（正己烷:甲基叔丁醚=200ml:200ml），振荡以提取PLFA甲酯，用滴管吸取上层正己烷相于另一干净试管，注意不要吸入杂质层和下层水相。15.洗涤：加3.0ml试剂4，上下摇

7、动5分钟，吸取三分之二上层溶液,转入气相色谱瓶(GC瓶，约1ml)，拧紧盖子，冷冻储存。如需浓缩，用氮吹在40℃电热干浴下浓缩至干，然后用200μl试剂3将甲基脂肪酸酯溶出，转移入内插管中。注意：提取过程中所用器皿不能接触塑料，玻璃器皿需要严格清洗，防止脂肪酸污染。