应用微生物改良法测定红细胞叶酸的研究

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1、应用微生物改良法测定红细胞叶酸的研究【关键词】红细胞叶酸摘要目的:研究微生物改良法测定红细胞叶酸的可靠性。方法:用本方法检测不同疾病患者100例和健康自愿者50例的红细胞叶酸含量。对高、低两个质控标准的精密度、稳定性及实验相关性等指标进行评价。结果:本方法化学性能的评价表明:批内变异系数为%和%，批间变异系数为%和%。各厂家的试剂相关性良好。50名健康自愿者测定结果表明RCF的正常参考值为±/mL。结论:本方法测定结果准确、可靠且操作简便，实验条件简单，适宜于推广。关键词红细胞叶酸;微生物改良法;巨幼细胞贫血血液中的

2、叶酸水平异常偏低，除与叶酸缺乏的巨幼细胞贫血有关外，还与胎儿神经管缺陷有关，引起同型半胱氨酸血症，可影响血管功能和增加卒中危险。因而血液中的叶酸水平的检测受到高度重视。测定叶酸的方法基本上是微生物改良法和竞争结合两类，我们用微生物改良法对红细胞叶酸进行了初步的研究。1材料和方法材料菌株制备:购买耐氯霉素乳酸菌冻干菌株。将冻干的菌株悬浮于5mL保养液37℃孵育18h后;混匀取1滴加入新的5mL保养液，37℃孵育18h后;混匀取加入5mL保养液，37℃孵育6h后;用生理盐水清洗5次，最后用5mL生理盐水悬浮。测量液:按培

3、养基，氯霉素，，，去离子水100mL的比例配制，以5mL为单位分装。保养液:每升测量液中加标准叶酸10mL，按5mL/支分装于无菌带塞试管，置-20℃可保存1年。标准叶酸浓度:10ng/mL。1.测定样本①定值高值质控标准=/mL，低值质控标准=/mL;分装后于-70℃保存，保证质控标准只冻融1次。②病人标本，不同疾病患者100例及健康自愿者50例，年龄25岁～40岁。所有标本均空腹，采肘静脉血2mL～3mL，置EDTA干燥管内，按1∶10比例稀释在1%的V-C液中于-20℃贮存。微生物测定法.1.按表1和表2操作配

4、制孵育试管。表1标准曲线管孵育前配制表红细胞叶酸标本孵育前配制.2.上述试管在37℃孵育18h后，摇匀，用721-分光光度计比浊。以叶酸浓度为横轴，以光密度值为纵轴做出标准曲线。试管1和试管2的OD值首先扣除同浓度空白对照管的OD值，然后由标准曲线查出该试管的叶酸值，标本的V-C血RCF=/2。标本的红细胞叶酸值按以下公式进行计算:RCF=［/红细胞压积］ng/mL。结果.1精密度实验取高、低值质控血清，平行测定20次，计算批内CV，低值血清CV=%，高值血清CV=%。连续测20d，计算批间CV，低值血清CV=%，高

5、值血清CV=%。.稳定性实验按照菌株制备方法将冻干的菌株打开后，测定并绘制标准曲线图，测定高值、低值质控的RCF值;同时用保养液使菌株长期保存。并分别在第3d、7d、14d、20d、30d、50d、75d、100d使用保养液的菌株绘制标准曲线图，测定高值、低值质控的RCF值。高值质控的CV=%、低值质控的CV=%。.相关实验取50份标本同时用本法与美国DPC公司提供的进口的叶酸放免试剂盒对RCF进行测定，相关系数r=。.正常参考值选取50名年龄在25岁～40岁健康人标本用本方法进行红细胞叶酸测定，用平均值±两个标准差

6、的方法进行统计计算正常参考值，测定结果表明RCF的正常参考值为ng/mL。讨论叶酸在体内代谢极为重要的单碳转运中起着关键性作用。血液中的叶酸缺乏除与巨幼细胞贫血有关外，还与胎儿神经管缺陷有关，引起同型半胱氨酸血症［1］，可影响血管功能和增加卒中危险［2，3］。由于红细胞内所含叶酸浓度比血清所含叶酸浓度高10倍～20倍，因而红细胞叶酸比血清叶酸更能代表组织内叶酸水平，当组织内叶酸水平已经缺乏，但尚未出现巨幼细胞贫血时，红细胞叶酸的测定对叶酸缺乏作出的决定更有价值［4］;而且血清叶酸的结果易受多种因素的影响，如:炎症、肝

7、病、肿瘤等［5］。因此虽然血清叶酸降低代表早期叶酸缺乏，但红细胞叶酸减低，不受外来因素的影响，确实反映了组织叶酸水平的减低。测定叶酸的方法基本上是微生物改良法和竞争结合法两类，后者操作简单、灵敏、但是价格昂贵，目前国内多数用于测定血清叶酸。当肝肾功能受损时，叶酸可以聚合。这种聚合体用竞争结合法不能测定;但微生物改良法可以测定血液中总叶酸值，因此用微生物改良法能满足临床测定肝、肾受损病人的总叶酸值。微生物改良法是经典的方法，材料来源广泛，并且用保养液可以使菌株长期保存。如果保存不当，致使菌株受杂菌污染或死亡，可以重新购

8、买冻干菌株，十分简单便利地重新建立该实验;不需要购买特殊仪器;对仪器和实验条件要求较低;适用于大批标本测定。本实验观察了长期保存的菌株，其实验稳定性良好;与美国DPC公司提供的进口的叶酸放免试剂相关性显著。因此便于在临床上推广使用。参考文献［1］SiriPW，VerhoefP，KokB6，B12aandfolate:Associ-ationwi