应用微生物改良法测定红细胞叶酸的研究

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1、应用微生物改良法测定红细胞叶酸的研究【关键词】红细胞叶酸摘要目的:研究微生物改良法测定红细胞叶酸（RCF）的可靠性。方法:用本方法检测不同疾病患者100例和健康自愿者50例的红细胞叶酸含量。对高、低两个质控标准的精密度、稳定性及实验相关性等指标进行评价。结果:本方法化学性能的评价表明:批内变异系数为2.228%和3.620%，批间变异系数为5.12%和7.51%。各厂家的试剂相关性良好（r=0.9544，n=50）。50名健康自愿者测定结果表明RCF的正常参考值为586.3±69.6ng/mL。结论:本方法测定结果准确、可靠且操作简便，实验条件简单，适宜于推广。关键词红细胞叶酸;微生物

2、改良法;巨幼细胞贫血血液中的叶酸水平异常偏低，除与叶酸缺乏的巨幼细胞贫血有关外，还与胎儿神经管缺陷有关，引起同型半胱氨酸血症，可影响血管功能和增加卒中危险。因而血液中的叶酸水平的检测受到高度重视。测定叶酸的方法基本上是微生物改良法和竞争结合两类，我们用微生物改良法对红细胞叶酸（RCF）进行了初步的研究。1材料和方法61.1材料1.1.1菌株制备:购买耐氯霉素乳酸菌（NCIMB10463）冻干菌株。将冻干的菌株悬浮于5mL保养液37℃孵育18h后;混匀取1滴加入新的5mL保养液，37℃孵育18h（该菌株可以在-4℃保存2W，用于菌株的繁殖）后;混匀取0.5mL加入5mL保养液，37℃孵育

3、6h后;用生理盐水清洗5次，最后用5mL生理盐水悬浮（简称清洗后6h菌株）。1.1.2测量液:按培养基2.35g，氯霉素0.02g，V-C0.1g，Tween-80（1∶10稀释）0.1mL，去离子水100mL的比例配制，以5mL为单位分装。1.1.3保养液:每升测量液中加标准叶酸10mL，按5mL/支分装于无菌带塞试管，置-20℃可保存1年。标准叶酸浓度:10ng/mL。　　1.3测定样本①定值高值质控标准=2.252ng/mL，低值质控标准=1.761ng/mL;分装后于-70℃保存，保证质控标准只冻融1次。②病人标本，不同疾病患者100例及健康自愿者50例，年龄25岁～40岁。所

4、有标本均空腹，采肘静脉血2mL～3mL，置EDTA干燥管内，按1∶10比例稀释在1%的V-C液中（称V-C血）于-20℃贮存。62微生物测定法2.1.按表1和表2操作配制孵育试管。表1标准曲线管孵育前配制表2红细胞叶酸标本孵育前配制2.2.上述试管在37℃孵育18h后，摇匀，用721-分光光度计（在波长λ=660mm处）比浊。以叶酸浓度为横轴，以光密度值（OD值）为纵轴做出标准曲线。试管1和试管2的OD值首先扣除同浓度空白对照管的OD值，然后由标准曲线查出该试管的叶酸值，标本的V-C血RCF（ng/mL）=（试管1叶酸值×0.04+试管2叶酸值×0.02）/2。标本的红细胞叶酸值（RC

5、F）按以下公式进行计算:RCF（ng/mL）=［（V-C血RCF×10）/红细胞压积］ng/mL。3结果3.1精密度实验取高、低值质控血清，平行测定20次，计算批内CV，低值血清CV=2.228%，高值血清CV=3.620%。连续测20d，计算批间CV，低值血清CV=5.12%，高值血清CV=7.51%。6　　3.2稳定性实验按照菌株制备方法将冻干的菌株打开后，测定并绘制标准曲线图，测定高值、低值质控的RCF值;同时用保养液使菌株长期保存。并分别在第3d、7d、14d、20d、30d、50d、75d、100d使用保养液的菌株绘制标准曲线图，测定高值、低值质控的RCF值。高值质控的CV=

6、5.18%、低值质控的CV=3.03%。3.3相关实验取50份标本同时用本法与美国DPC公司提供的进口的叶酸（固相非煮沸双相计数）放免试剂盒对RCF进行测定，相关系数r=0.9544。3.4正常参考值选取50名年龄在25岁～40岁健康人标本用本方法进行红细胞叶酸测定，用平均值±两个标准差的方法进行统计计算正常参考值，测定结果表明RCF的正常参考值为（586.3±69.6）ng/mL。4讨论叶酸在体内代谢极为重要的单碳转运中起着关键性作用。血液中的叶酸缺乏除与巨幼细胞贫血有关外，还与胎儿神经管缺陷有关，引起同型半胱氨酸血症［1］，可影响血管功能和增加卒中危险［2，3］。由于红细胞内所含叶

7、酸浓度比血清所含6叶酸浓度高10倍～20倍，因而红细胞叶酸比血清叶酸更能代表组织内叶酸水平，当组织内叶酸水平已经缺乏，但尚未出现巨幼细胞贫血时，红细胞叶酸的测定对叶酸缺乏作出的决定更有价值［4］;而且血清叶酸的结果易受多种因素的影响，如:炎症、肝病、肿瘤等［5］。因此虽然血清叶酸降低代表早期叶酸缺乏，但红细胞叶酸减低，不受外来因素的影响，确实反映了组织叶酸水平的减低。测定叶酸的方法基本上是微生物改良法和竞争结合法两类，后者操作简单、灵敏、但是价