蝉花中ISP 类免疫活性组分含量测定的研究

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时间:2018-09-29

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1、蝉花中ISP类免疫活性组分含量测定的研究作者:杨明静王伯初余佳文毛先兵朱华李【摘要】  目的建立快速、高效测定蝉花ISP类免疫活性组分含量的方法。方法采用茚三酮比色法测定ISP类次生代谢产物的含量,通过线性度和线性范围、精密度、稳定性及准确度等指标评价该方法。结果该方法检测线性范围为6~30μg/ml,相关系数为0.9997,平均回收率为101.20%,RSD为0.79%。结论茚三酮比色法简便快捷、结果稳定、灵敏度高,可作为测定蝉花ISP类免疫活性组分的有效方法。【关键词】蝉花ISP比色法Abstrac

2、t:ObjectiveToestablisharapidandsensitivemethodfordeterminationofthecontentofISP-likeimmunoregulationalingredientinC.cicadae.MethodsThecontentofISP-likeingredientswasdeterminedbyninhydrincolorimetricmethod.Thevalidityandveracityofthemethodwereevaluatedthr

3、oughsomeindexessuchaslinearityandrange,precision,stability,andaccuracy.ResultsThelinearrangewas6~30μg/ml,thecorrelationcoefficientwas0.9997,theaveragerecoveryratewas101.20%,andRSDwas0.79%.ConclusionThemethodisconvenient,rapid,accurate,andsensitive.Itcanb

4、eusedfortheeffectiveanalysisofthecontentofISP-likeimmunoregulationalingredientinC.cicadae.Keywords:Cordycepscicadae;ISP;Colorimetry  蝉花是我国传统的一种名贵中药,与冬虫夏草一样同属虫菌复合体,且含有相近的化学成分,医家常将其用作冬虫夏草的代用品。医学研究表明,它具有显著的免疫调节、抗疲劳和改善肾功能的作用[1]。而有关蝉花药理物质基础的报道仍然较少[2]。Fujita等[

5、3]通过细胞模型从蝉花培养滤液中筛选得到的免疫活性成分ISP-1,具有显著的双向免疫调节作用,免疫抑制力比环孢菌素A更强且副作用小[3,4]。由于蝉花ISP类次生代谢产物含量较低,难以检测,目前尚未见定量测定其含量的报道。基于ISP类物质为长脂链α-氨基酸,与茚三酮共热时生成蓝紫色的酮茚胺,在一定范围内吸光度和氨基酸含量成正比[5],本研究采用茚三酮比色法定量测定蝉花ISP类物质的含量,建立起一种快捷有效测定ISP类物质的方法。1器材与方法仪器与试剂UV-1601紫外可见光分光光度计;JA1003A电子

6、天平;201型升降恒温水浴锅;NKA非极性大孔吸附树脂;6230M型pH酸度计;L-丝氨酸;茚三酮。其余试剂均为分析纯,水为去离子水。方法样品溶液制备蝉花菌培养滤液2L上大孔吸附树脂NKA柱,柱高23cm,内径2.8cm。分别用水2L,50%乙醇2L洗柱,直至流出液无色,流出液弃之,再用1L乙醇洗脱,收集流分,减压浓缩至干,10ml甲醇溶解。进行比色测定时,取1ml甲醇溶液乙二醇甲醚稀释50倍。比色测定方法参见文献[6],略作改进。准确称量丝氨酸3.0mg,用水湿润溶解后转入100ml容量瓶中,加水稀释

7、至刻度,摇匀,得30μg/ml丝氨酸对照溶液。吸取一定量丝氨酸对照溶液或样品溶液于20ml具塞刻度试管中,不足1.0ml则用水补足,依次加入1.0ml醋酸-乙酸钠缓冲溶液,1.0ml1%茚三酮乙二醇甲醚溶液,0.1ml0.1%抗坏血酸溶液,摇匀,盖上塞,于90℃水浴加热30min,取出冷水冷却15min,加入3ml60%乙醇稀释,摇匀,以试剂空白为参比,在567nm处测量其吸光度A567nm。薄层检测准确称量丝氨酸3.0mg,加入2ml水溶解作为薄层点样液。吸取上述点样液5μl,样品甲醇溶液40μl,分

8、别点于同一硅胶GF254-CMCNa薄层板上,0.2%茚三酮-乙醇溶液喷雾,110℃加热显色。再吸取样品甲醇溶液40μl,蝉花发酵液10倍浓缩液40μl分别点于之前同一薄层板上,以氯仿-甲醇-水为展开剂展开,取出晾干,0.2%茚三酮-乙醇溶液喷雾,110℃加热显色。结果与讨论.1最大吸收波长的确定分光光度法测定物质含量时,首先须确定反应体系的最大吸收波长。分别精密吸取样品溶液、丝氨酸对照溶液和水1.0ml,按方法“1.2.2”项,以水为参比

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