蝉花中ＩＳＰ 类免疫活性组分含量测定的研究

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1、蝉花中ＩＳＰ类免疫活性组分含量测定的研究作者：杨明静王伯初余佳文毛先兵朱华李【摘要】　　目的建立快速、高效测定蝉花ＩＳＰ类免疫活性组分含量的方法。方法采用茚三酮比色法测定ＩＳＰ类次生代谢产物的含量，通过线性度和线性范围、精密度、稳定性及准确度等指标评价该方法。结果该方法检测线性范围为６～３０μｇ／ｍｌ，相关系数为０．９９９７，平均回收率为１０１．２０％，RSD为０．７９％。结论茚三酮比色法简便快捷、结果稳定、灵敏度高，可作为测定蝉花ＩＳＰ类免疫活性组分的有效方法。【关键词】蝉花ＩＳＰ比色法Abstract：ObjectiveＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｒａｐｉｄａｎｄｓｅｎｓ

2、ｉｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄfordeterminationofｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＩＳＰ－ｌｉｋｅｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｌｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｉｎC．cicadae．MethodsＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＩＳＰ－ｌｉｋｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｎｉｎｈｙｄｒｉｎｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｖａｌｉｄｉｔｙａｎｄｖｅｒａｃｉｔｙｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈｓｏｍｅｉｎｄｅｘｅｓｓｕｃｈａｓｌｉｎｅａｒｉｔｙａｎｄｒａｎｇｅ，ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄａｃｃｕｒａｃｙ

3、．ResultsＴｈｅlinearｒａｎｇｅｗａｓ６～３０μｇ／ｍｌ，ｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｗａｓ０．９９９７，ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅｗａｓ１０１．２０％，ａｎｄRSDｗａｓ０．７９％．ConclusionＴｈｅｍｅｔｈｏｄｉｓｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ，ｒａｐｉｄ，ａｃｃｕｒａｔｅ，ａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅ.ItcanbeusedfortheｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓoftheｃｏｎｔｅｎｔｏｆＩＳＰ－ｌｉｋｅｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｌｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｉｎC．cicadae．Keywords：Cordyc

4、epscicadae；ＩＳＰ；Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ　　蝉花是我国传统的一种名贵中药，与冬虫夏草一样同属虫菌复合体，且含有相近的化学成分，医家常将其用作冬虫夏草的代用品。医学研究表明，它具有显著的免疫调节、抗疲劳和改善肾功能的作用［１］。而有关蝉花药理物质基础的报道仍然较少［２］。Ｆｕｊｉｔａ等［３］通过细胞模型从蝉花培养滤液中筛选得到的免疫活性成分ＩＳＰ－１，具有显著的双向免疫调节作用，免疫抑制力比环孢菌素Ａ更强且副作用小［３，４］。由于蝉花ＩＳＰ类次生代谢产物含量较低，难以检测，目前尚未见定量测定其含量的报道。基于ＩＳＰ类物质为长脂链α－氨基酸，与茚三酮共热时生成蓝紫

5、色的酮茚胺，在一定范围内吸光度和氨基酸含量成正比［５］，本研究采用茚三酮比色法定量测定蝉花ＩＳＰ类物质的含量，建立起一种快捷有效测定ＩＳＰ类物质的方法。1器材与方法仪器与试剂ＵＶ－１６０１紫外可见光分光光度计；ＪＡ１００３Ａ电子天平；２０１型升降恒温水浴锅；ＮＫＡ非极性大孔吸附树脂；６２３０Ｍ型ｐＨ酸度计；Ｌ－丝氨酸；茚三酮。其余试剂均为分析纯，水为去离子水。方法样品溶液制备蝉花菌培养滤液２Ｌ上大孔吸附树脂ＮＫＡ柱，柱高２３ｃｍ，内径２．８ｃｍ。分别用水２Ｌ，５０％乙醇２Ｌ洗柱，直至流出液无色，流出液弃之，再用１Ｌ乙醇洗脱，收集流分，减压浓缩至干，１０ｍｌ甲醇溶解。进行比

6、色测定时，取１ｍｌ甲醇溶液乙二醇甲醚稀释５０倍。比色测定方法参见文献［６］，略作改进。准确称量丝氨酸３．０ｍｇ，用水湿润溶解后转入１００ｍｌ容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得３０μｇ／ｍｌ丝氨酸对照溶液。吸取一定量丝氨酸对照溶液或样品溶液于２０ｍｌ具塞刻度试管中，不足１．０ｍｌ则用水补足，依次加入１．０ｍｌ醋酸－乙酸钠缓冲溶液，１．０ｍｌ１％茚三酮乙二醇甲醚溶液，０．１ｍｌ０．１％抗坏血酸溶液，摇匀，盖上塞，于９０℃水浴加热３０ｍｉｎ，取出冷水冷却１５ｍｉｎ，加入３ｍｌ６０％乙醇稀释，摇匀，以试剂空白为参比，在５６７ｎｍ处测量其吸光度Ａ５６７ｎｍ。薄层检测准确称量丝氨酸３

7、．０ｍｇ，加入２ｍｌ水溶解作为薄层点样液。吸取上述点样液５μｌ，样品甲醇溶液４０μｌ，分别点于同一硅胶ＧＦ２５４－ＣＭＣＮａ薄层板上，０．２％茚三酮－乙醇溶液喷雾，１１０℃加热显色。再吸取样品甲醇溶液４０μｌ，蝉花发酵液１０倍浓缩液４０μｌ分别点于之前同一薄层板上，以氯仿－甲醇－水为展开剂展开，取出晾干，０．２％茚三酮－乙醇溶液喷雾，１１０℃加热显色。结果与讨论.1最大吸收波长的确定分光光度法测定物质含量时，首先须确定反应体系的最大吸收波长。分别精密吸取样品溶液、丝氨酸对照溶液和水１．０ｍｌ，按方法“１．２．２”项，以水为参比