蝉花中ｉｓｐ 类免疫活性组分含量测定的研究论文

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1、蝉花中ＩＳＰ类免疫活性组分含量测定的研究论文.freelinationofｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＩＳＰ－ｌｉｋｅｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｌｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｉｎC．cicadae．MethodsＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＩＳＰ－ｌｉｋｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｎｉｎｈｙｄｒｉｎｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｖａｌｉｄｉｔｙａｎｄｖｅｒａｃｉｔｙｏｆｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈｓｏｍｅｉｎｄｅｘｅｓｓｕｃｈａｓｌｉ

2、ｎｅａｒｉｔｙａｎｄｒａｎｇｅ，ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ..毕业，ａｎｄａｃｃｕｒａｃｙ．ResultsＴｈｅlinearｒａｎｇｅｗａｓ６～３０μｇ／ｍｌ，ｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｗａｓ０．９９９７，ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅｗａｓ１０１．２０％，ａｎｄRSDｗａｓ０．７９％．ConclusionＴｈｅｍｅｔｈｏｄｉｓｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ，ｒａｐｉｄ，ａｃｃｕｒａｔｅ，ａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅ.Itcanbeusedfortheｅｆｆｅ

3、ｃｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓoftheｃｏｎｔｅｎｔｏｆＩＳＰ－ｌｉｋｅｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｌｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｉｎC．cicadae．Keywords：Cordycepscicadae；ＩＳＰ；Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ蝉花是我国传统的一种名贵中药，与冬虫夏草一样同属虫菌复合体，且含有相近的化学成分，医家常将其用作冬虫夏草的代用品。医学研究表明，它具有显著的免疫调节、抗疲劳和改善肾功能的作用［１］。而有关蝉花药理物质基础的报道仍然较少［２］。Ｆｕｊｉｔａ等［３］通过细胞模型从蝉花培养

4、滤液中筛选得到的免疫活性成分ＩＳＰ－１，具有显著的双向免疫调节作用，免疫抑制力比环孢菌素Ａ更强且副作用小［３，４］。由于蝉花ＩＳＰ类次生代谢产物含量较低，难以检测，目前尚未见定量测定其含量的报道。基于ＩＳＰ类物质为长脂链α－氨基酸，与茚三酮共热时生成蓝紫色的酮茚胺，在一定范围内吸光度和氨基酸含量成正比［５］，本研究采用茚三酮比色法定量测定蝉花ＩＳＰ类物质的含量，建立起一种快捷有效测定ＩＳＰ类物质的方法。1器材与方法1.1仪器与试剂ＵＶ－１６０１紫外可见光分光光度计（日本ＳＨＩＭＡＤＺＵ）；ＪＡ１

5、００３Ａ电子天平（上海精天电子仪器厂）；２０１型升降恒温水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂）；ＮＫＡ非极性大孔吸附树脂（天津南开大学化工厂）；６２３０Ｍ型ｐＨ酸度计（上海洪纪仪器设备有限公司）；Ｌ－丝氨酸（上海康达氨基酸厂）；茚三酮（上海三爱思试剂有限公司）。其余试剂均为分析纯，水为去离子水。1.2方法1.2.1样品溶液制备蝉花菌培养滤液２Ｌ上大孔吸附树脂ＮＫＡ柱，柱高２３ｃｍ，内径２．８ｃｍ。分别用水２Ｌ，５０％乙醇２Ｌ洗柱，直至流出液无色，流出液弃之，再用１Ｌ乙醇洗脱，收集流分，减压浓缩至干，１０

6、ｍｌ甲醇溶解。进行比色测定时，取１ｍｌ甲醇溶液乙二醇甲醚稀释５０倍。1.2.2比色测定方法参见文献［６］，略作改进。准确称量丝氨酸３．０ｍｇ，用水湿润溶解后转入１００ｍｌ容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得３０μｇ／ｍｌ丝氨酸对照溶液。吸取一定量丝氨酸对照溶液或样品溶液于２０ｍｌ具塞刻度试管中，不足１．０ｍｌ则用水补足，依次加入１．０ｍｌ醋酸－乙酸钠缓冲溶液（ｐＨ５．４），１．０ｍｌ１％茚三酮乙二醇甲醚溶液，０．１ｍｌ０．１％抗坏血酸溶液，摇匀，盖上塞，于９０℃水浴加热３０ｍｉｎ，取出冷水冷却１５

7、ｍｉｎ，加入３ｍｌ６０％乙醇稀释，摇匀，以试剂空白为参比，在５６７ｎｍ处测量其吸光度Ａ５６７ｎｍ。1.2.3薄层检测准确称量丝氨酸３．０ｍｇ，加入２ｍｌ水溶解作为薄层点样液。吸取上述点样液５μｌ，样品甲醇溶液４０μｌ，分别点于同一硅胶ＧＦ２５４－ＣＭＣＮａ薄层板上，０．２％茚三酮－乙醇溶液喷雾，１１０℃加热显色。再吸取样品甲醇溶液４０μｌ，蝉花发酵液１０倍浓缩液４０μｌ分别点于之前同一薄层板上，以氯仿－甲醇－水（６５∶３０∶５）为展开剂展开，取出晾干，０．２％茚三酮－乙醇溶液喷雾，１１０℃加热显

8、色。2结果与讨论2.1最大吸收波长的确定分光光度法测定物质含量时，首先须确定反应体系的最大吸收波长。分别精密吸取样品溶液、丝氨酸对照溶液和水１．０ｍｌ，按方法“１．２．２”项，以水为参比于３００～６００ｎｍ波长下进行全波长扫描，结果如图１所示。可见样品溶液反应产物在５６７ｎｍ处有最大吸光度，与对照品丝氨酸反应产物扫描结果相同（结果未给出），与文献报道氨基酸反应产物扫描结果一致［７］；空白液在４５０ｎｍ以后基本无吸收。由此确定５６７ｎｍ为测定波长。2.2反应温度和反应时间的确定精密吸取丝氨酸对照溶