白细胞弹性蛋白酶抑制剂筛选模型的建立及抑制剂F02ZA2554A的研究

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1、白细胞弹性蛋白酶抑制剂筛选模型的建立及抑制剂F02ZA2554A的研究作者：智慧任晓司书毅穆栋路新华崔晓兰董悦生张华贺建功【摘要】利用人源的白细胞弹性蛋白酶建立了一种快速、微量、灵敏的高通量体外筛选方法。利用该模型从微生物菌种库菌株的次生代谢产物中筛选得到一阳性真菌F02ZA2554。该菌株发酵液经有机溶剂提取、硅胶柱层析、及HPLCODS反相柱层析等活性跟踪下的分离纯化，得到活性化合物F02ZA255A，该化合物对白细胞弹性蛋白酶有中等强度的抑制活性，其IC50为μmol/L。通过对该化合物的紫外、质谱、核磁等理化分析，确定该化合物为蒽醌类化合物中的大黄素甲

2、醚(physcion)，该化合物的抗炎活性属首次报道。【关键词】人白细胞弹性蛋白酶抑制剂大黄素甲醚抗炎作用StudiesonthehighthroughputscreeningassayforHLEinhibitorABSTRACTUsingLpyroglutamylLprolylLvalinepNAasthesubstrate,ahighthroughputscreeningassaywasdevelopedforscreeningHLEinhibitorswithhighS/Nratios(>5)andZ′factors(>).Inscreeni

3、ngforHLEinhibitorsfrommetabolitesofmicroorganisms,acompoundnamedF02ZA2554AwasisolatedfromfungalbrothwithIC50μmol/L.Thespectrumdata(UV,IR,MSandNMR)showedthatitisphyscion,whichistheubiquitouscomponentinmanykindsofherbs.Theseresultsmayberevealedthemechanismofphysciononantiinflammation,w

4、hichhasneverbeenreportedbefore.KEYWORDSHumanleukocyteelastaseinhibitor;Physcion;Antiinflammation人白细胞弹性蛋白酶(humanleukocyteelastase，HLE)是人体中的一种蛋白水解酶，它直接作用于肺、肝脏、肾脏等结缔组织中的弹性蛋白、胶原蛋白、蛋白多糖等胞外基质。体内弹性蛋白酶表达过多或活性过高均可导致严重的组织损伤，并造成或加重多种如肺气肿、慢性支气管炎、脓血症、肾炎、类风湿关节炎和某些皮肤症等疾病［1～4］。因此，弹性蛋白酶抑制剂已经成为治疗上述疾病药物

5、的重要研发方向之一。另外由于弹性蛋白酶可以破坏胶原纤维及组织基底膜层，在肿瘤的形成和肿瘤转移方面起关键作用，所以弹性蛋白酶已经成为抗癌新药的作用靶点［5，6］。本研究利用显色方法建立了一种高通量的人白细胞弹性蛋白酶抑制剂体外筛选模型，经验证该模型快速、灵敏、稳定。为了寻找新的HLE抑制剂，利用该模型对微生物的次生代谢产物进行了高通量的药物筛选，并从一株真菌的发酵液中分离得到活性化合物F02ZA255A，经结构确定为大黄素甲醚(physcion)，该化合物的抗炎活性此前未见报道。本文就模型的建立、阳性菌株的筛选、活性化合物的分离及生理活性进行阐述。1材料与方法筛选

6、用微生物的菌株放线菌和真菌由本室微生物菌种库提供，微生物的代谢产物经溶媒提取作为筛选样品。试剂及仪器人白细胞弹性蛋白酶(humanleukocyteelastase，HLE)和多肽底物均购自Sigma公司；Victor1420多标记分析仪(美国PE公司)；GenesysTM红外分光光度计(美国Nicolet公司)；质谱(AutospecUltima)；核磁共振500MHz(Inova)。HLE活性测定原理及方法HLE活性测定原理与方法参考文献［7］，并稍加改动。以化学标记的多肽nitroanilide为底物，利用水解后的产物nitroanilide在405nm有

7、特定吸收，通过测定酶反应前后光吸收A值的变化，确定HLE酶的活性。反应式如下：HLE多肽Valnitroanilide→多肽+nitroanilide(405nm)筛选的操作过程为：在96孔板中加入测试样品，加HLE酶液100μl，再加入2μl的筛选样品，用DMSO作为空白对照。使用Victor1420多标记分析仪在405nm波长处读取每孔A值(样品本底A)；加入底物100μl，37℃保温反应120min后再次读取每孔的A值，并计算抑制率。抑制率(%)=［A2-A1］(对照)-［A2-A1］(样品)［A2-A1］(对照)-［A2-A1］(空白)×100%F0