罗格列酮抑制NE和PMA诱发心肌肥大的研究

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1、罗格列酮抑制NE和PMA诱发心肌肥大的研究【摘要】目的：研究罗格列酮(RSG)抑制去甲肾上腺素(NE)诱导的心肌肥大与蛋白激酶C，NE和PKC的阻断剂白屈菜季氨碱观察罗格列酮在NE和PMA诱导心肌肥大中对PKC活性和cfos的影响.结果：PMA和NE均可促进心肌细胞蛋白质的合成和3H亮氨酸的掺入,并可增强心肌细胞PKC活性，同时使PKC从胞质移位到细胞膜,RSG和che均有抑制蛋白质合成和3H亮氨酸掺入的作用,还有抑制心肌细胞PKC活性的作用，RSG和che还可抑制NE增加cfos蛋白的表达.

2、结论：RSG抑制NE引起心肌肥大与PKC和cfos有关.【关键词】去甲肾上腺素;罗格列酮;蛋白激酶C;佛波醇酯类；心肌/细胞学【Abstract】AIM:Toinvestigatetheinhibitoryeffectsofrosiglitazone(RSG)onnoradrenalininducedcardiacmyocytehypertrophyandthemechanisminvolved.METHODS:NEhasbeenshowntobeapotentstimulatorforneona

3、talratventricularmyocytehypertrophyinvitro.WeusedtheactivatorofPPARγ(RSG),theinhibitorofprotEinkinaseC(PKC)chelerythrine(che)toinfluenceprotEInleucineincorporationandactivityofPKCweremeasuredoncardiacmyocytesstimulatedbyChronicNEorPMA诱导心肌肥大的影响和机制，以阐明RS

4、G在抗心肌肥大中作用.PKC广泛参与细胞信号转导、分泌、离子通道调节、细胞增殖、分化和癌变等一系列与生命相关的过程，是生物和医学界研究的一个热点.PKC抑制剂可以阻止α1受体激动剂所致心肌肥大，推测PKC可能是引起心肌肥厚的重要转导因子.那么RSG抑制由NE，PMA诱导的心肌肥大与PKC和cfos有何关系?PKC是否是NE，PMA和RSG在心肌细胞内信号转导的共同通路，我们应用PKC的阻断剂白屈菜季氨碱(chelerythrine，che)，RSG，PMA和NE等来观察对心肌肥大和蛋白质合成的影响，

5、同时采用测定PKC活性,寻找与PKC关系的证据，并探讨其相关机制.1材料和方法材料1～d龄新生SD品系大鼠乳鼠由第四军医大学实验动物中心提供.新生牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司生产；考马斯亮蓝G250由华美生物工程公司提供；高糖DMEM培养基、5′溴脱氧尿苷和ITS是GIBCO产品;che，PMA，NE，胶原酶1均为Sigma公司的产品,RSG是Alexis公司的产品，PKC试剂盒为Upstate公司的产品，WesternBlot试剂盒为博士德公司的产品.方法新生大鼠心肌细胞的分离与培养

6、按参考文献［2-3］,在无菌条件下取出乳鼠的心脏，剪碎，用胶原酶1消化成单细胞悬液，离心弃上清，加入含100mL/L新生牛血清，mmol/LBrdu的高糖DMEM重新悬浮，孵育90min，收集未贴壁细胞(95%以上为心肌细胞)用于实验.总蛋白含量测定将心肌细胞接种于24孔培养板，NE+10-5mol/Lche组，PMA+RSG组,培养4h,吸弃培养液，用生理盐水洗两次，每孔加入/L的NaOH溶液1mL,加热10min,每孔吸出200μL细胞裂解液，与考马斯亮蓝染液混匀，放置10min,以可见光分度计

7、(BeckmanDU800)在59nm测定溶液的光吸收值，以溶剂为空白对照，牛血清白蛋白为标准品作标准曲线，测定各孔总蛋白含量.测定心肌细胞的3H亮氨酸掺入将细胞浓度［×105细胞/(mL·孔)］的心肌细胞接种于24孔培养板上,每4孔为1组，7h换入含亮氨酸50μL和各种药物,继续培养4h.将细胞收集于玻璃纤维滤膜上.100mL/L三氯醋酸破碎细胞并固定，用蒸馏水反复冲洗，以除去游离的同位素标记物.滤膜烘干后置于含mL闪烁液的固定瓶内，用LS3801液体闪烁仪(Beckman)测定放射性强度.测定

8、心肌细胞PKC的活性按参考文献［4］和PKC检测试剂盒说明进行.裂解细胞、分离提取胞质与胞膜内蛋白质,紫外分光光度法测定蛋白浓度.以上操作均在冰上而进行.吸取含有相同质量蛋白质的胞质与胞膜提取液，加入［r32P］ATP和底物，37℃温浴min,点膜，37℃烘干，液体闪烁仪记数测定放射性强度，根据公式计算细胞膜和细胞质的PKC活性.WesternBlot测定Cfos蛋白的表达分离、接种和培养心肌细胞，将培养板中的细胞分为：正常对照组、NE处理组、NE