蜂产品中土霉素残留的酶联免疫检测

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1、分类号：V。806546密级：华中农业大学硕士学位论文蜂产品中土霉素残留的酶联免疫检测EnzymeLinkedImmunosorbentAssayforOxytetracyclinefromBeeProduets研究生：邢淑婕指导教师：陈福生教授专业：微生物学获得学位名称：理学硕士研究方向：食品安全获得学位时间：华中农业大学食品科技学院二oo五年六月华中农业大学2005届硕士学位论文蜂产品中土霉素残留的酶联免疫检测摘要本研究通过制备土霉素(oxytetracycline，OTC)的特异性抗体，建立了蜂产品中土霉素残留的酶联免疫吸附分析法(enzyme-l

2、inkedimmunosorbentassay，ELISA)。具体包括以下四个方面的内容：1土霉素人工抗原的构建OTC分子量为460．2，是只有反应原性而无免疫原性的小分子物质，必须与蛋白质等载体结合转化为完全抗原后才能刺激动物产生抗体。由于OTC分子结构中含有氨基，所以可以以该基团为“桥梁”将OTC和载体蛋白连接起来。本研究首先分别以碳化二亚胺(1·ethy1-3·(3一dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochlofide，EDC)和戊=醛(commercialglutaraldehyde，GA)作为偶联剂，将OT

3、C与牛血清白蛋白(bovineserulnalbumin，BSA)进行偶联，合成了复合物OTC．BSA，并分析了不同连接剂对蛋白偶联效果的影响。结果表明，以EDC或GA为偶联剂，均可得到OTC与BSA的偶联物，但是偶联物中OTC与BSA的摩尔比有很大的差异，以EDC为偶联剂时OTC：BSA摩尔比为4．00：l，而以GA作为偶联剂时仅为2．58：1，这说明EDC的偶联效果比GA的好。进一步就OTC与BSA偶联时，BSA、OTC及偶联剂的混合方法对偶联物摩尔比的影响进行了研究，结果显示，向BSA溶液中边搅拌边缓慢地滴加OTC和EDC溶液时OTC—BSA偶联物

4、中OTC与BSA的摩尔比较高，达7．97：1。该连接物注射BALB／e小鼠后能获得较好的抗体。本研究还在上述研究的基础上制各了OTC与卵清白蛋白(ovalbumin，OV)的偶联物OTC．0V。2抗OTC抗体的制备以自制的OTC·BSA(摩尔比为7．97：1)连接物为免疫抗原注射BALB／c小白鼠，从抗体的产生进程来看，小鼠在第一次免疫后45天开始有明显的抗体产生，90天达到高峰，然后开始下降，间接非竞争ELISA测得其最高效价为1：20，000；进～步用间接竞争ELISA分析了此抗体的灵敏度与特异性，结果表明，所得抗体的灵敏度和特异性都较好，和其它结构

5、相似或相近物质的交叉反应率较低。3几种蜂产品中ffrc的ELISA检测对蜂蜜、蜂花粉、蜂王浆中OTC的提取方法进行了研究，得出了它们的最佳提蜂产品中土霉素残留的ELISA检测取方法和条件。以自制的抗血清建立的间接竞争ELISA法对几种蜂产品中OTC的残留量进行了检测，所建立的间接竞争ELISA方法对土霉素的检测范围为5-200ng／ml，相关系数r=0．9951，在此范围内对人工污染样品的平均回收率为97．5％-v107．O％。4试剂盒的试制在上述研究基础上进行了ELISA试剂盒的试制，ELISA试剂盒经适当处理后，4"C放置2个月和。20℃放置2．5个

6、月，以间接非竞争ELISA测定的吸光值分别是起始时的1110和l／3．关键词：蜂产品；土霉素；抗原；抗体；ELISA儿兰!查些查兰!塑!堡堡圭堂垡堡塞一EnzymeLinkedImmunosorbentAssayOxytetracyclinefromBeeProductsAbstractEnzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)wasdevelopedforanalysingoxytetrocycline(OTC)fromthebeeproducmusingtheanti—OTCantibody．Mainresearch

7、contentswerefollowed：1PreparationforOTC。BSAOTCishapten，whichonlyhasrcactiongenicitybutnoimmunogenicity,duetoitslowmoleculeweight(460．2)．Itmaybechangedintocompleteantigen，whichcanstimulateanimaltoproduceanfibody，whenOTCisconjugatedwithcarrier-proteinsuchasbovineserLllnalburnln(BSA

8、)，ovalbumin(OV)etc．OTCcanbedirectlyCOnju