酶解和冻融辅助超声提取光合细菌中辅酶q10的研究

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1、万方数据亿学与生物Z程2008。v01．25№．8C№mistry&Bi∞ngir啪ring盈酶解和冻融辅助超声提取光合细菌中辅酶Q10的研究许芳，张淑荣，张鹏(北京化工大学生命科学与技术学院，北京100029)摘要：研究了酶解及冻融辅助超声提取光合细茵中辅酶Q10的最佳工艺条件，建立了辅酶Q10高产光合茵株的快速筛选方法。结果表明，超声可有效破碎细胞，以提取胞内辅酶Q10，而结合酶解及冻融可以达到更好的效果，在优化条件下，辅酶Q10的提取率分别提高5．1％和9．4％。关键词：辅酶Qlo；超声破碎；酶解；冻融中图分类号：Q814．1文献标识码：A文章

2、编号：1672—5425(2008)08一0043一03辅酶Q10，又名泛醌(Ubiquinone)，是一种脂溶性醌类化合物。辅酶Q10可与线粒体内膜相结合，在呼吸链中起载体作用；另外，因其醌式及侧链异戊烯基结构等特点，还是重要递氢体和细胞能量生成要素，并具有抗氧化和控制细胞内氧气流动等性能，在生命体中发挥着重要的生理功能。目前，辅酶Q10已广泛应用于药品、功能食品、保健品、化妆品及减肥品等[1]，辅酶Qlo对心血管疾病、帕金森氏综合症、糖尿病等疾病也具有预防和治疗作用[2“]。有统计显示，国际市场上，辅酶Q10的用量以每年15％～20％的速度递增[

3、5]。微生物发酵法在辅酶Q10的生产方法中最有发展前途，无论在成本还是产品质量等方面都较其它方法优越，是全球开发的热点。筛选出辅酶Q10的高产菌株是有效降低成本、提高辅酶Q10产量的根本，故而对快速筛选工艺的探索很有必要。利用超声方法提取天然产物有效成分具有操作简便快速、无需加热、提取率高、效果好、结构不被破坏等优势，具有良好的应用前景[6]。作者在此研究了酶解及冻融辅助超声提取光合细菌中辅酶QlO的最佳工艺条件，建立了辅酶Q10高产光合细菌的快速筛选方法。l实验1．1菌体、试剂与仪器光合细菌从活性污泥(燕山石化)、湖水(北京元大都遗址、北海等)中富

4、集纯化得到。辅酶Q10标准品，Sigma公司；甲醇和乙醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。722S型可见分光光度计，HP孓250型生化培养箱，Lc-10AT型高效液相色谱，JY98—3D型超声波细胞粉碎机，RE一52AA型旋转蒸发器等。1．2培养基NH4Cl1．Og，CH3C00Na3．Og，MgCl2O．1g，NaCl2．Og，NaHC031．0g，K2HP04o．2g，酵母膏0．2g，水1000mL，pH值7．0。1．3光合细菌富集培养及发酵在30℃、60W条件下，对光合细菌富集物进行光照厌氧培养，5d后取微红培养物接种至第2瓶富集培养基中继续培养，

5、重复2～3次，再用分离培养基进行划线分离，得到光合细菌的纯化菌株。将纯化后的光合细菌接种至三角瓶中的培养基，在30℃、60w白炽灯下培养4d，待菌液混浊或发酵液发生颜色变化，停止培养。1．4细胞破碎及辅酶QlO的提取1．4．1超声破碎提取取500mL发酵液离心，在所得湿菌体中加入30mL丙酮，使用超声波细胞粉碎机对其进行破碎。破碎功率为800～1600W，每工作5s间隔8s。4000r·min．1离心30min，弃上清液，所得菌体加入石油醚，剧烈振荡5min，萃取2次，取上清液，用去离子水洗至中性，再以无水硫酸钠除去水分，减压浓缩，用无水乙醇溶解，得

6、辅酶Q10的粗提液，低温保存。1．4．2溶菌酶酶解辅助超声破碎提取溶菌酶是专门作用于微生物细胞壁的水解酶，酶解条件为：pH值7．2的O．2m01·L-1的磷酸钾缓冲溶液，O．8m01．L-1的氯化钾溶液，O．5％的溶菌酶。在30℃将菌体振荡不同时间后离心，菌体酶解后加入．收稿日期：2008一04一01作者简介：许芳(1982一)，女，山东威海人，硕士研究生，主雯从事微生物育种与发酵方面的研究；通讯联系人：张鹏。副教授。E-mail：sthi2008@yahoo．com．cn．zhangpeng@mail．b咖t．edu．cn。盈——许万方数据芳等：蘸

7、解和冻融辅助超声提取光合细菌中辅酶Qlo的研究／2008年一8_丙酮，再进行超声破碎提取，方法同1．4．1。1．4．3冻融辅助超声破碎提取将菌体放入冰箱冷冻一定时间，加入丙酮后，进行超声破碎提取，方法同1．4．1^1．5辅酶QlO浓度测定1．5．1可见分光光度法口]取辅酶Q10标准品，配制成不同浓度的乙醇溶液，分别加入氰基乙酸乙酯和氢氧化钾的乙醇溶液，30℃下暗室中放置30min，以无水乙醇为空白，在620nm下测其吸光度，绘制标准曲线。将辅酶Q10粗提品溶解在4mL无水乙醇中，加入1mL氰基乙酸乙酯和1mL5％KOH的乙醇溶液，摇匀。同法测其吸光度

8、，对照标准曲线计算发酵液中辅酶Q10的浓度。1．5．2HPLC法嘲．色谱条件为：C，。柱；流动相为甲醇：乙醇