蜂花粉总黄酮检测方法的研究

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1、蜂花粉总黄酮检测方法的研究孙丽萍、田文礼、朱晓丽、董捷(中国农业科学院蜜蜂研究所)摘要黄酮类成分因其具有多样生物活性成为目前天然产物研究的热点。本研究通过三种检测方法的比较，确定了聚酰胺一紫外分光光度法为蜂花粉总黄酮的测定方法，其检测波长为360nm，以芦丁为标准品，在0．005-0．025mg／ml范围内，其浓度与吸光度呈良好的线性关系，相关系数R2为0．9998，平均回收率分别为98．17％，稳定性、精密度和重现性均理想，其RSD分别为2．124％(n=3)，0．488％(n=3)、0．875％(n=5)。该法检测油菜蜂花粉中总黄酮含量为1．54％。关键词蜂花粉，总黄酮，聚酰胺一Uv

2、法，比色法，双波长比色法目前，国内外对总黄酮的检测有若干种方法：比色法、胶束毛细管电泳法、高效液相一色谱(HPLC)法等，大量实验数据表明，对于蜂花粉中黄酮类化合物的含量，采用不同分析方法所得到的结果不同。’比色法是在碱性溶液中加A13+与3一羟基黄酮、5一羟基黄酮进行络合反应，利用颜色和含量关系进行比色测定的方法。这是早期常用的方法，由于此法设备廉价，操作简单，现在国内有许多文献报道的仍然采用此法(梁惠花，2003；魏永生，2004；王开发，2004)。比色法用于组成单一的标准对照物时，结果准确，但当应用于组成复杂的植物试样时，比如花粉黄酮提取液，由于花粉组成复杂，受到花色素、鞣酸及其

3、它酚性成分等多种物质的干扰，在碱性条件下，许多多元酚都可与A13+发生同样的显色反应，而且底液常常出现混浊现象，从而影响结果的准确性，使得测定结果远远高于蜂花粉总黄酮的实际含量。为克服底液强吸收带来的干扰，研究人员对传统的比色法进行了改进，陈郑镔在使用‘传统的硝酸铝显色法时先用聚酰胺对样液进行吸附，以减少非黄酮类物质的显色干扰。郑敏燕(2004)采用双波长分光光度法，使用510nm为测定波长，584rlm为参比波长，采用比色法测定油菜蜂花粉中的总黄酮，由于扣除了底液混浊等背景干扰，取得了比较满意的实验结果。但双波长比色法的原理基于比色法，许多测定条件如稀释用乙醇浓度、显色时间等都能影响比

4、色法的最终结果，导致测定结果偏高、重现性不好。聚酰胺一紫外分光光度法(出自《保健食品检验与评价技术规范》2003年版)是检测保健食品中黄酮类化合物的常用方法(蒋娅萍，2003)，具有操作简单，设备要求低，检测速度快，重现性好，灵敏度高等优点，但在蜂花粉黄酮检测中未见应用。本实验考察了比色法、双波长比色法和聚酰胺一紫外分光光度法三种方法测定蜂花粉总黄酮的差异，考察了不同前处理方法对检测结果的影响，建立了一种最适用于蜂花粉总黄酮的检测方法，改变了由于蜂花粉黄酮检测方法不同导致所测黄酮含量结果不一致、缺乏．统一标准，从而造成无法以黄酮为指标对蜂花粉及其制品进行评价的现状，为现行蜂花粉标准中所缺

5、乏的功效指标的建立提供了有价值的参考依据，具有一定的理论意义和实际应用价值。1．材料与方法1．1样品与试剂油菜蜂花粉由中国农科院蜜蜂研究所提供，聚酰胺粉由巴陵石化有限责任公司提供，芦丁标准品由上海友思生物技术有限公司提供，NaNO。、Al(N03)。、NaOH、乙醇、甲醇、苯均为国产分析纯试剂．831．2仪器设备HW．SY21-K电热恒温水浴锅北京市长风仪器仪表公司KQ一50DB数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司精密电子天平梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司WF2UV-2100紫外可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司1．3．标准曲线的建立，1．3．1聚酰胺法芦丁标准液t精密称取在

6、105℃干燥恒重的芦丁对照品5．Omg，用甲醇溶解，摇匀，定容至lOOmL，使之成为浓度为50斗g／mL的芦丁标准品溶液，作为贮备液备用。样品处理：精密称取样品1．09，加乙醇定容至25mL，摇匀后，超声提取20min，放置。标准曲线的制作：精密吸取芦丁标准溶液(50}Ig／mL)．0、1．0、2．0、3．0、4．0、5．OmL于lOmL比色管中，加甲醇至刻度，摇匀，于波长360nm下测定吸光度，见表l。对所测得的数据采用直线回归法计算出标准曲线的回归方程，并以吸光度为横坐标，对照品的浓度为纵坐标绘制标准曲线图。．供试样品的测定方法：精密吸取处理后的样品上清液1．OmL，于蒸发皿中，加l

7、g聚酰胺粉吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱，先用20mL苯洗脱，弃苯，然后用25mL甲醇洗脱总黄酮，定容为25mL。此液于360nm波长处测定吸光度，并计算样品中总黄酮的含量。，1．3．2比色法：芦丁标准溶液：精密称取在105"C干燥恒重的芦丁对照品10．Omg，加甲醇溶解并定容至lOmL，此溶液浓度为1000斗g／mL。样品处理：精密称取样品1．09，加乙醇定容至25mL，摇匀后，超声提取20min，放置。标准曲线的制作：精