功能性蛋白pEGF在枯草芽孢杆菌中的表达与制备

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1、全日制硕士专业学位（毕业）论文功能性蛋白pEGF在枯草芽孢杆菌中的表达与制备学位申请人：董兵指导教师：檀建新教授学位名称：工程硕士研究领域：食品工程授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月二日分类号：TS201.3单位代码：10086密级：公开学号：20169070496功能性蛋白pEGF在枯草芽孢杆菌中的表达与制备ExpressionandPreparationofFunctionalProteinpEGFinBacillusBubtilis学位申请人：董兵指导教师：檀建新教授学位名称：工程硕士研究领域：食品工程授予

2、单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月二日摘要枯草芽孢杆菌是食品加工用酶制剂的主要生产菌种，也是某些功能性食品的发酵菌种，因此，它已成为食品基因工程中研究最为广泛的菌种之一，针对其构建的枯草芽孢杆菌表达系统可高效表达多种外源性食品中常用酶和蛋白质。在表达系统中，载体是外源蛋白能否成功表达的必要且关键因素，因此，构建一套结构完整、功能多样的表达载体，可为外源酶或功能蛋白在枯草芽孢杆菌中高效表达提供新素材。猪肉食品中抗生素物质大量残留，威胁人类健康。功能性蛋白pEGF具备较好的促生长功能和生物安全性，在抗生素替代物研究方面具

3、备很大的潜力，但是其提取纯化困难，产量低，限制了其规模化的生产。利用食品基因工程技术，通过枯草芽孢杆菌表达系统实现pEGF的外源高效表达，并进行初步发酵条件摸索，可为其规模化生产打下基础。本试验构建了一套用于B.subtilis的载体，并对其性能进行检验，然后将该载体应用于pEGF蛋白的外源表达，内容如下：1.以穿梭载体pDG150为基础，通过重组改造构建了B.subtilis的系列载体，并验证了它们的表达能力和稳定性。其中，pTD160为基础载体，pTD161为表达载体，pTD162为表面展示载体。将lipa基因导入上述p

4、TD系列载体，转化B.subtilis168中表达，利用RashidNp-NPP比色法检测其lipA酶活性为23.4U/mg和15.31U/mg，表明载体能高效表达lipA蛋白。通过无抗生素压力传代培养，培养10代后发现其稳定性仍为96.5％和95%，证明构建成功的重组质粒具备较高的稳定性。2.将功能性蛋白pEGF的基因pegf按大肠杆菌密码子优化后合成，分别导入pTD161和pTD162，转化B.subtilis，检测其表达量，并优化其诱导培养条件。ELISA法检测Bs168-pTD162-pegf中pEGF蛋白表达量可达

5、365ng/mL，Bs168-pTD162-pegf芽孢的蛋白表达量为285ng/mL，证明其得到表达。同时，对其诱导培养条件进行优化，优化后的表达量提高到380ng/mL。3.将pegf导入pET21b，并转化BL21，诱导表达，检测其表达量为783ng/mL，然后对pEGF进行初步分离纯化，其纯化后可蛋白量达723ng/mL。4.将pEGF和GFP融合表达，之后导入pTD161和pTD162并转化B.subtilis168，检测其荧光信号和融合蛋白表达量。通过融合PCR获得pEGF和GFP融合蛋白基因pegf-gfp。将

6、其导入pTD161转化B.subtilis168，IPTG诱导表达，ELISA检测pEGF蛋白表达量为358ng/mL，并通过荧光显微镜检测可见荧光信号，表明pEGF-GFP获得表达。将融合基因pegf-gfp导入pTD162，转化B.subtilis168，用DSM培养基收集芽孢，检测pEGF蛋白表达量为268ng/mL，用荧光显微镜检测其荧光信号，证明pEGF-GFP获得表达。关键词：枯草芽孢杆菌；穿梭表达载体；表面展示载体；pEGF；pEGF-GFPExpressionandPreparationofFunctiona

7、lProteinpEGFinBacillusBubtilisName:DongBingMajor:FoodEngineeringSupervisor:TanJianxinAbstractBacillussubtilisisthemainproducerofenzymepreparationsforfoodprocessing,anditisalsoafermentativestrainofcertainfunctionalfoods.Therefore,ithasbecomeoneofthemostwidelystudied

8、strainsinfoodgeneticengineering.TheBacillussubtilisexpressionsystemconstructedforitcanefficientlyexpressavarietyofenzymesandproteinscommonlyusedi