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时间:2018-09-15
《纤溶酶原激活物抑制剂1+sirna治疗实验性肝纤维化》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、第二军医大学博士学位论文纤溶酶原激活物抑制剂-1siRNA治疗实验性肝纤维化姓名:胡平方申请学位级别:博士专业:内科学(消化系病)指导教师:谢渭芬;林勇20100501纤溶酶原激活物抑制剂一lsiRNA治疗实验性肝纤维化纤溶酶原激活物抑制剂.1siRNA治疗实验性肝纤维化摘要【研究背景及目的】肝纤维化(hepaticfibrosis)的特征性病理改变是肝内细胞外基质(extracellulaxmatrix,ECM)的过多沉积.减少ECM沉积、促进ECM降解是治疗肝纤维化的关键环节。由尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase.typeplasminogenactivator,uPA)、
2、纤溶酶(plasmin)、纤溶酶原激活物抑制剂一l(plasminogenactivatorinhibitor-1,PAl.1)和基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)构成的反应体系是调节ECM降解的主要途径之一,在肝纤维化形成和发展中起重要作用。uPA位于纤维化调控的上游,可激活纤溶酶原形成纤溶酶,后者可进一步活化MMPs;纤溶酶和活化的MMPs均可降解胶原、蛋白多糖等ECM成分。PAl.1可与uPA结合,抑制uPA对纤溶酶原的激活作用,从而促进ECM沉积和肝纤维化发展。正常生理情况下,体内aPA和PAl.1表达处于平衡状态,而在肝纤维化发生过程
3、中,uPA活性逐渐降低,PAI.1表达则不断增高,过多表达的PAl.1通过与uPA结合抑制其纤溶激活作用,进而导致uPA、纤溶酶和MMPs系统活性下调,ECM沉积明显增加,加重肝纤维化程度。本科室前期研究表明,在肝纤维化过程中上调uPA表达可以改善肝纤维化进程;此外,近期多项研究结果还显示,PAl.1基因敲除小鼠对纤维化形成具有保护作用,而PAl.1过表达小鼠可加重纤维化的发生发展。因此,我们设想通过下调肝纤维化过程巾PAl.1的表达可能达到治疗肝纤维化的目的。小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)技术是以转录后调控为目的的新型基因调控与治疗技术。通过合成反
4、义小分子RNA特异性抑制靶基凶的转录后表达。RNA干扰(RNAinterfering,RNAi)具有操作简单,可调控性和靶向性强、高效抑制靶基因表达等优点。本研究以肝纤维化过程中上调的PAl.1基因作为靶点,利用siRNA技术,通过体外、体内实验研究PAl.1siRNA对实验性肝纤维化的治疗效果,为抗肝纤维化治疗提供新的靶点和途径。第二军医大学博士学位论文【实验方法】一、筛选PAl-1siRNA应用RNAi设计软件,设计并合成针对PAl.1mRNA219、559、1061和2665位点的4对21核苷酸(nt)siRNA,分别转染大鼠肝星状细胞(hepaticstellatecell,H
5、SC)株HSC.T6。以转染非特异siRNA(NCsiRNA,与PAI.1mRNA无同源性的2lntsiRNA)作为阴性对照,应用实时定量RT-PCR(real-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction,realtimeRT-PCR)和Westernblot方法检测四对siRNA分子对PAl.1基因及蛋白水平的阻抑效率,筛选出针对PAl.1mRNA高效的siRNA片段。二、PAl.1siRNA对HSC-T6生物学特性的影响通过细胞悬液转染以及构建稳定株两种方法将筛选出的PAl.1siRNA转染至HSC.T6内,应用realtimeR
6、T-PCR法检测肝纤维化基因mRNA表达;酶联免疫吸附法(enzyme—linkedimmunosorbentassay,ELISA)测定HSC.T6上清I、ⅡI型胶原含量;四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyltetrazolium,MTT)法测定细胞增殖变化;流式细胞术检测分析细胞周期等生物学特性的影响。三、针对PAl.1siRNA的腺病毒载体—一AdshPAl的构建以及鉴定合成针对219位点的PAlshRNA片段,利用pSuper载体的Hl启动子,体外连接构建重组腺病毒质粒pAdshPAI,经293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒AdshPAI,同法构建对照病毒AdNC
7、(与PAl.1mRNA无同源性的NCshRNA)和表达绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)病毒AdGFP。将AdshPAl和AdNC分别体外感染HSC-T6,以RT-PCR法检测AdshPAl对PAI.1的抑制效果。四、AdshPAl体内导入对实验性肝纤维化的治疗作用分别构建胆总管结扎(bileduetligation,BDL)和二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)两种大鼠肝纤维化模型
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