番茄环斑病毒hcrtpcrelisa检测

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1、!"卷#期微生物学报%&’(!"-&(##$$"年!月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$)*+,’#$$"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!番茄环斑病毒!"#$%#&"$#’()*+检测"赵文军=，#安德荣#朱水芳=""黄文胜=陈红运=（=国家质检总局动植物检疫实验所北京=$$$#>）（#西北农林科技大学杨凌?=#=$$）摘要：番茄环斑病毒（D&EF%）是我国对外检疫一类有害生物，目前国内尚无存在的报道。G0E技术是一种快速灵敏的植物病毒检测方法，但核酸内的聚合酶抑制物

2、会导致漏检现象，而只通过凝胶电泳进行结果判定会出现假阳性，这两方面限制了G0E技术在对外检疫中的应用。利用共价结合在G0E管壁上的引物特异性杂交诱捕核酸粗提液中的靶标核酸，洗掉杂质及抑制物质，在同一管内作ED/G0E，凝胶电泳检测液相产物的同时对固相产物进行杂交检测，提高了结果的可靠性及灵敏度。利用所建立的H0/ED/G0E/2IJF)成功地从法国进口葡萄苗中检出D&EF%。本方法还可用于其他植物病毒及转基因产品的检测。关键词：番茄环斑病毒，植物检疫，杂交诱捕G0E中图分类号：F!"#K=文献标识码：)文章编号：$$$=/L#$>（#$$"）$#/$=

3、?!/$L番茄环斑病毒（D&34M&+,;N8*&MO,+78，D&EF%）广泛分布于欧美及大洋洲，能侵染葡萄、桃、苹果、樱桃、番茄及烟草等=1$多种作物，引起多种病害，严重时导致绝产［=，#］。D&EF%为豇豆花叶病毒科线虫传多面体病毒属的成员，主要通过嫁接传播，远距离传播主要靠种子苗木等［"］。目前国内尚无存在的报道，但它适生于我国大部分地区，自然寄主遍及全国，且许多为重要的经济作物。一旦传入，可导致严重的经济损失，因此D&EF%被我国列为一类检疫有害生物，实施严格检疫。反转录聚合酶链式反应（EAOA+8AM+4;8<+,*M,&;/*’&P3A+

4、48A<64,;+A4

5、固相产物进行杂交检测，有效避免了假阳性现象。,材料和方法,-,实验材料带毒番杏由动植物检疫实验所提供，带毒苹果、葡萄、李、樱桃、普通烟、桃由法国进口"国家转基因植物研究与产业化专项课题（./$$/0/$$1）""通讯作者。2/34,’：567869:8,;4(<&3作者简介：赵文军（=>?1/），男，山东人，硕士，主要从事植物病原学研究，2/34,’：564&@A;B7;:8&67(<&3收稿日期：#$$#/$?/$C，修回日期：#$$#/=#/=#万方数据J期赵文军等：番茄环斑病毒BA2#!2OA#2@=;$’检测(C/苗木中截获，健康样品采自北京郊

6、区。!"#引物及探针的设计根据!"#$%#&’(复制酶基因)个株系序列保守区，利用*+,-.+/01设计引物及探针。!#23：/425675665886876685576575294!#2#：/4287758776687675756686294探针：/4:;<2768576658866865576875878657685294!"$诱捕用%&’管的包被向杂交诱捕管（由动植物检疫实验所研制）中加入(11包被缓冲液（(11--">?=/4端!=氨基化!#2#，(1--">?=@:A，(11--">?=甲基咪唑*BC01），/1D密封温育/E。洗液（(11-

7、-">?=!+,F2BA>*BC0/，(/1--">?=&6A>，10(G!H..I2J1）洗管9次，然后用无菌水洗9次，)D保存备用。!"(植物材料总’)*提取10JK10/5植物材料加液氮研磨至粉末，按(5LJ-=的比例悬浮于#&’抽提液（(--">?=@:!’，(G$:$，10JG巯基乙醇），混匀，J倍体积的水饱和酚?氯仿?异戊醇（J/LJ)L(）抽提9次，无水乙醇沉淀，室温干燥，溶于(11!=无菌水中，MJ1D保存。!"+总’)*的诱捕取酚?氯仿?异戊醇抽提(次后的上清液/1K(11，加入到包被有反向引物的杂交诱捕!=管中，C1D/-,I，)/

8、D保温91-,I，$!@（J1--">?=!+,F2A>*BN01，(11--">?=&6A>