RT-LAMP技术检测烟草环斑病毒的研究【毕业设计】

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1、本科毕业设计（20__届）RT-LAMP技术检测烟草环斑病毒的研究目　录1引言12正文主体12.1供试材料12.2引物设计12.3烟草环斑病毒的RT-LAMP扩增22.3.1总RNA提取22.3.2RT-LAMP扩增22.3.3RT-LAMP结果分析22.4RT-LAMP的检测反应温度优化试验22.5RT-LAMP的检测反应时间优化试验22.6RT-LAMP的特异性试验22.7RT-LAMP的灵敏度试验22.8烟草环斑病毒RT-PCR检测方法的建立22.9烟草环斑病毒的RT-LAMP扩增产物的结果鉴定方法研究22.10大豆样品中的TRSV的RT-LAM

2、P快读检测23结果与分析33.1实验结果33.1.1RT-LAMP的检测反应温度优化试验结果33.1.2RT-LAMP的检测反应时间优化试验结果33.1.3烟草换班病毒的RT-LAMP特异性扩增结果33.1.4RT-LAMP检测灵敏度试验43.1.5扩增产物的结果鉴定方法研究43.1.6大豆样品中TRSV的RT-LAMP快速检测结果53.2讨论54小结6致谢7参考文献8附录9摘要为了提高TRSV检测的准确性及检测效率，缩短检测时间，降低检测成本，本研究建立了一种快速、简便的RT-LAMP检测烟草环斑病毒的方法。首先，合成本研究设计的引物，配制扩增混合体

3、系，同时设置一个空白对照和一个阳性对照；然后，在60℃水浴锅中恒温扩增60min；最后，采用琼脂糖凝胶电泳或SYBRgreenI染色的方法判断扩增结果，若有瀑布状条带出现或者溶液呈黄绿色，表示在样品中检测出了目标病毒，没有出现瀑布状条带或者溶液呈橘红色，则表示没有检测出目标病毒。采用本研究建立的RT-LAMP方法对大豆TRSV阳性样品进行检测，并用荧光染料SYBRGreenI法观察，结果显示，阳性样品均显示明显的绿色。关键词烟草环斑病毒；环介导等温扩增；检测。AbstractABSTRACTInordertoimprovingtheaccuracyan

4、dtheefficiencyofdetectingTRSV,shortenthedetectiontime,reducingthedetectioncost,thestudyestablishedarapidandsimpleTRSVdetectionmethodsusingLoop-mediatedisothermalamplification(LAMP).Firstcompoundprimersthathavebeendevisedinthisstudy,preparemixsystemforamplification,setaqapcrossre

5、ferenceandapositivecrossreference.Thenamplifyin60℃waterbathpotfor60min.AtlastagarosegelelectrophoresisorSYBRgreenIdyingareusedtodeterminetheamplificationresult,ifwaterfallstripeorkellysolutionappears,thatmeansthepositiveabouttarqetvirus,ifnowaterfallstripeappearsortangerinesolut

6、ion,thatmeanstheneqativeabouttarqetvirus.UsingthismethodstodetecttheTRSVpositivesampleandthefluorescentdyeSYBRGreenIwereusedtoobservetheresult,itshowsthatpositivesamplesshowobviousgreen。KEYWORDSTobaccoringspotvirus(TRSV);Loop-mediatedisothermalamplification(LAMP);detection。1引言烟草

7、环斑病毒（Tobaccoringspotvirus，TRSV）隶属豇豆花叶病毒科（Comoviridae）线虫传多面体病毒属（Nepovirus），是中国进境检疫法规中明确规定禁止入境的危害性有害生物。该病毒寄主范围广，可侵染52科246种植物，是果树、蔬菜、花卉等经济作物的重要病害之一，发生严重时可导致绝产。中国进口的植物种球茎和苗木中携带该病毒的风险很大[1]。目前，国内外针对用RT-PCR和IC-RT-PCR技术检测植物病毒的研究已有不少[3~5]。TRSV所用的检测技术主要有DAS-ELISA[2]、RT-PCR技术和IC-RT-PCR技术[6

8、]等。相比传统的电镜观察和生物学鉴定，这3种方法在检测周期方面具有明显的优势，操作简单方便。但