GBT28081-2011烟草环斑病毒检疫鉴定方法.pdf

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1、ICS65．020．01B16囝圄中华人民共和国国家标准GB／T28081—2011烟草环斑病毒检疫鉴定方法Detectionandidentificationoftobaccoringspotvirus2011-12-30发布2012-06-01实施宰瞀鬻鬻瓣警糌瞥翼发布中国国家标准化管理委员会厘111刖罱GB／T28081--20”本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC／TC271)提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国上

2、海出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈青、林石明、杨翠云、张毅、陈红运、廖富荣、郑云、李斌。1范围烟草环斑病毒检疫鉴定方法GB／T28081—2011本标准规定了烟草环斑病毒检疫鉴定的基本原则和方法。本标准适用于可能携带烟草环斑病毒的种子、苗木、鳞球茎、组培苗等繁殖材料及其产品的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文侔。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用

3、于本文件。SN／T1146植物检疫烟草环斑病毒检疫鉴定方法。3烟草环斑病毒基本信息中文名：烟草环斑病毒。学名：tobaccoringspotvirus。缩写：TRSV。属豇豆花叶病毒科Comoviridae，线虫传多面体病毒属Nepovirus病毒。TRSV的传播途径多样，可以通过种子、嫁接、机械接种和介体传播。烟草环斑病毒其他信息参见附录A。4方法原理利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA)、体外反转录和体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行检测鉴定。5仪器设备、用具及

4、试剂5．1仪器设备洗板机、酶联检测仪、高速冷冻离心机、电子天平(感量0．001g)、超净工作台、旋涡混合仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、榨汁机、水浴锅。5．2用具微量移液器(O．5pL，2pL，10pL，20pL，100pL，200pL，1000弘L)、化学PCR反应管和(或)96孔光化学PCR反应板、酶联板、研钵。5．3试剂双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂(见B．1)。】GB／T28081—2011反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测试剂(见C．1)。实时荧光RT-PCR检测试剂(见D．1

5、)。Ic_RT-PCR检测试剂(见E．1)。6种苗的检测鉴定6．1种子检测鉴定挑取500粒种子(重点挑取畸形、不成熟的种子)播于灭菌土中，待长出3片～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号。采集的叶片分成两份，分别用于酶联测定和分子生物学检测。也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联铡定和分子生物学检测。6．2苗木、组培苗检测鉴定有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同6．1。6．3鳞球茎检测鉴定取鳞球茎的小芽或鳞片进行酶联测定和分子生物学检测。6．4植物产品的检测

6、鉴定植物产品有症状的部分单独检测。没有症状或无法的观察症状的植物产品，应按比例取样，检测方法为酶联测定和分子生物学检测。7检测7．1双抗体夹心酶联免疫吸附测定把制备的样品上清液加入已包被TRSV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测，每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料(如：种子或叶片)应尽量与检测样品相一致。具体操作见附录B。7．2RT-PCR检测分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增

7、。健康的植物组织作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录c。7．3实时荧光PeR检测分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行实时荧光PCR检测。健康的植物组织作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录D。7．4IC-RT-PCR检测把制备的样品上清液加入已包被TRSV抗体的离心管中，然后进行IC-RT-PCR扩增。健康的植2物组织作阴性对照，感染TRSV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。具体操作见附录E。8结果判定GB／T28

8、081—20117．1、7．2、7．3、7．4中如果两种方法的检测结果为阳性，即可判断该批种苗携带烟草环斑病毒。一般是酶联测定为阳性后，分子生物学检测为阳性即可判断为携带有烟草环斑病毒。必要时可进行生物接种试验，具体操作按照SN／T1146规定的方法执行。9样品保存、结果记录与资料保存9．1样品保存经检验确定携带烟草