SNT1146-2002植物检疫烟草环斑病毒检疫鉴定方法.pdf

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1、植物检疫-烟草环斑病毒检疫鉴定方法Plantquarantine—MethodforinspectionandidentificationoftobaccoringspotNepovirusSN／T1146—2002前言本标准附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈枝楠、郑文华、邓琼、王东勇。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。1范围本标准规定了进境植物检疫中对烟草环斑病毒的检疫鉴定方法。本标准适用于进境植物种子、苗木、繁殖材料和植物产品中烟草环斑病毒的检疫鉴定。2原理烟草环斑病毒(Tobacco

2、ringspotNepovirus，简称TRSV)为等轴多面体球状病毒，直径为25nm～29nm，属线虫传多面体病毒属成员。可侵染54科、246种植物，其中主要的经济作物有：豆类、马铃薯、甘薯、烟草、西瓜、黄瓜、甜瓜、胡萝卜、唐菖蒲、百合、鸢尾、李属、苹果、葡萄、甜樱桃等。该病毒主要分布于北美、大洋洲、欧洲、非洲等国家，具有寄主广泛，危害症状明显、免疫原性强、容易制备高滴度、专业性强的病毒抗血清等特点。通过血清学双抗体夹心法(DAS-ELISA)和鉴别寄主生物学鉴定方法或免疫电镜检测，可以作为检疫工作中检疫鉴定该病毒的依据。3仪器3.1研钵3.2微量榨汁机3.3酶标仪3.4低速离心机(转速为4

3、000r／min)3.5生物培养箱(具有光照，温度可调范围为0℃～50℃)3.6酶联板(48孔或96孔)3.7Eppendorf管(体积为1.5mL)3.8微量移液器(分为100μL、200μL、1000μL单头，100μL或200μL8孔道一支及相应吸头)3.9恒温水浴锅或恒温培养箱3.10分析电子天平3.11pH计3.12白瓷盘(40crux50cm)及钝头镊子3.13隔离检疫温、网室4试剂4.110×PBST缓冲液将氯化钠(NaCl)80g、磷酸二氢钾(KH2P04)2g、磷酸氢二钠(Na2HP04)11.5g、氯化钾(KCl)2g、吐温20(Tween-20)5mL溶解于1000mL蒸

4、馏水中形成的液体。4.2样品提取缓冲液将亚硫酸钠(Na2S03)1.3g、聚乙烯基吡咯烷酮(MW24～4000，PVP)20g、叠氮钠(NaN3)0.2g、吐温20(Tween-20)20mL溶解于1000mLPBST中，用浓盐酸(HCl)调节pH值至7.4，并储存于4℃。4.3包被缓冲液将碳酸钠(Na2C03)1.59g、碳酸氢钠(NaHC03)2.93g、叠氮钠(NaN3)0.2g溶解于1000mL蒸馏水中，用浓盐酸(HCl)调节pH值至9.6，并储存于4℃。4.4洗涤缓冲液将1×PBST缓冲液用浓盐酸(HCl)调节pH值至7.4，并储存于4℃。4.5酶标结合物缓冲液将1×PBST缓冲液8

5、00mL、小牛血清白蛋白(BSA)2g、PVP(MW24～4000)20g、叠氮钠(NaN3)0.2g用蒸馏水定容至1000mL，并储存于4℃。4.6PNPP底物缓冲液将二乙醇胺97mL、叠氮钠(NaN3)0.2g溶解于1000mL蒸馏水中，用浓盐酸(HCl)调节pH值至9.8，并储存于4℃。4.7PNPP底物溶液将4一硝基酚磷酸钠盐(p-nitrophenylphosphate，英文简称为PNPP)100mg溶解于PNPP缓冲液100mL中，现用现配制。4.8终止反应液将氢氧化钠(NaOH)40g溶解于1000mL蒸馏水中。4.9种子表面消毒液将30％次氯酸钠100mL溶解于900mL蒸馏水

6、中制成浓度为3％的消毒液。4.10生物试剂可采用烟草环斑病毒检测试剂盒或生物检测试剂。包括烟草环斑病毒抗体(IgG)，碱性磷酸酶标记的烟草环斑病毒酶标抗体(IgG-Enzyme-Conjugated)，阳性对照和阴性对照。4.112％醋酸铀染液将2g醋酸铀溶解于98mL蒸馏水中，定容至100mL，现配现用。注：本标准未作特殊说明，所使用试剂均为分析纯。5现场检疫与抽样5.1抽查按货物批量总件数的5％～20％随机抽查，最低抽查件数10件，不够最低检查数量件数的全部检查。5.2抽样按照附录A的规定随机抽取植物种子、苗木、鳞球茎或其繁殖材料样品。5.3检测样品每批货物送检检测样品种子应不少于1000

7、粒，鳞球茎应不少于20个(头)，苗木或其繁殖材料应不少于10株(枝)。若少于10株(枝)时应全部送检。6检疫鉴定6.1双抗体夹心法(DAS—ELISA)6.1.1样品制备6.1.1.1种子类随机抽取100粒种子经3％次氯酸钠表面消毒10min后，用无菌水洗涤三次，将种子置于铺有吸水纸的白瓷盘中，分五组将种子分列其中，在适宜的发芽温度(20℃～28℃)条件下催芽，直至长出第一对真叶(发芽时间大约一周