snt 1146-2002 植物检疫 烟草环斑病毒检疫鉴定方法

《snt 1146-2002 植物检疫 烟草环斑病毒检疫鉴定方法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1146-2002植物检疫烟草环斑病毒检疫鉴定方法Plantquarantine-MethodforinspectionandidentificationoftobaccoringspotNepovirus2002一11一25发布2003一05一01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T1146-2002前言本标准附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准

2、主要起草人:陈枝楠、郑文华、邓琼、王东勇。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。SN/T1146-2002植物检疫烟草环斑病毒检疫鉴定方法范围本标准规定了进境植物检疫中对烟草环斑病毒的检疫鉴定方法。本标准适用于进境植物种子、苗木、繁殖材料和植物产品中烟草环斑病毒的检疫鉴定。2原理烟草环斑病毒(TobaccoringspotNepovirus，简称TRSV)为等轴多面体球状病毒，直径为25nm^29nm，属线虫传多面体病毒属成员。可侵染54科、246种植物，其中主要的经济作物有:豆类、马铃薯、甘薯、

3、烟草、西瓜、黄瓜、甜瓜、胡萝卜、唐营蒲、百合、莺尾、李属、苹果、葡萄、甜樱桃等。该病毒主要分布于北美、大洋洲、欧洲、非洲等国家，具有寄主广泛，危害症状明显、免疫原性强、容易制备高滴度、专业性强的病毒抗血清等特点。通过血清学双抗体夹心法(DAS-ELISA)和鉴别寄主生物学鉴定方法或免疫电镜检测，可以作为检疫工作中检疫鉴定该病毒的依据。3仪器3.1研钵3.2微量榨汁机3.3酶标仪3.4低速离心机(转速为4000r/min)3.5生物培养箱(具有光照，温度可调范围为。'C-50,C)3.6酶联板(4

4、8孔或96孔)3.7Eppendorf管(体积为1.5mL)3.8微量移液器(分为100pL,200pL,l0001,L单头，100pL或200t}L8孔道一支及相应吸头)3.9恒温水浴锅或恒温培养箱3.10分析电子天平3.11pH计3.12白瓷盘(40cmX50cm)及钝头镊子3.13隔离检疫温、网室试剂4.110xPBST缓冲液将氯化钠(NaCI)80g,磷酸二氢钾(KH,PO,)2g,磷酸氢二钠(Na,HPO,)11.5g,氯化钾(KCl)2g、吐温20(Tween-20)5mI溶解于10

5、00ml蒸馏水中形成的液体4.2样品提取缓冲液将亚硫酸钠(Na,SO,)1.3g,聚乙烯基毗咯烷酮(MW24--4000,PVP)20g,叠氮钠(NaN,)0.2g,吐温20(Tween-20)20ml.溶解于1000ml.PBST中，用浓盐酸(HCl)调节pH值至7.4，并储存于4℃。SN/T1146-20024.3包被缓冲液将碳酸钠(Na_CO,)1.59g,碳酸氢钠(NaHCO,)2.93g,叠氮钠(NaN,)0.2g溶解于1000mL蒸馏水中，用浓盐酸(HCI)调节pH值至9.6，并储存

6、于4'C,4.4洗涤缓冲液将1XPBST缓冲液用浓盐酸(HCl调节pH值至7.4，并储存于4"C,4.5酶标结合物缓冲液将1XPBST缓冲液800ml、小牛血清白蛋白(BSA)2g,PVP(MW24--4000)20g,叠氮钠(NaN,)0.2g用蒸馏水定容至1000ml，并储存于4'C,4.6PNPP底物缓冲液将二乙醇胺97mL,叠氮钠(NaNO0.2g溶解于1000mL蒸馏水中，用浓盐酸(HCD调节pH值至9.8，并储存于40C.4.7PNPP底物溶液将4-硝基酚磷酸钠盐(p-nitroph

7、enylphosphate，英文简称为PNPP)100mg溶解于PNPP缓冲液100ml中，现用现配制。4.8终止反应液将氢氧化钠(NaOH)40g溶解于1000mL蒸馏水中。4.9种子表面消毒液将30%次氯酸钠100mr溶解干900m工蒸馏水中制成浓度为3%的消毒液。4.10生物试剂可采用烟草环斑病毒检测试剂盒或生物检测试剂。包括烟草环斑病毒抗体(IgG),碱性磷酸酶标记的烟草环斑病毒酶标抗体(IgGEnzyme-Conjugated),阳性对照和阴性对照。4.112%醋酸铀染液将2g醋酸铀溶

8、解于98mL蒸馏水中，定容至100mL，现配现用。注:本标准未作特殊说明，所使用试剂均为分析纯5现场检疫与抽样5.1抽查按货物批量总件数的5%-20%随机抽查，最低抽查件数10件，不够最低检查数量件数的全部检查。52抽样按照附录A的规定随机抽取植物种子、苗木、鳞球茎或其繁殖材料样品。5.3检测样品每批货物送检检测样品种子应不少于1000粒，鳞球茎应不少于20个(头)，苗木或其繁殖材料应不少于10株(枝)。若少于10株(枝)时应全部送检。6检疫鉴定6.1双抗体夹心法(DAS-ELISA)6.1.1