SNT2670-2010番茄环斑病毒检疫鉴定方法.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!"!#!"#$"!$%$番茄环斑病毒检疫鉴定方法$%&'&()*(+*,+()*-*.&)*/(/-)/0&)/'*(123/)4*'%2!$%$5%%5$%发布!$%%5$&5$%实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２６７０—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈

2、红运、邓丛良、陈青、赵文军、黄文胜、廖富荣、林石明、朱水芳。Ⅰ犛犖／犜２６７０—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售番茄环斑病毒检疫鉴定方法１范围本标准规定了番茄环斑病毒检疫鉴定方法。本标准适用于可能携带番茄环斑病毒的进境种子、苗木、组培苗等繁殖材料的检疫与鉴定。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＳＮ／Ｔ１８６０植物病毒免疫电镜检测方法ＳＮ／Ｔ２１２２进出境植物及植物产品检疫抽样３原理３．１学名与分类地位学名：ｔｏｍａｔｏｒｉｎｇｓｐｏｔ

3、ｖｉｒｕｓ缩写：ＴｏＲＳＶ分类地位：豇豆花叶病毒科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ）；线虫传多面体病毒属（犖犲狆狅狏犻狉狌狊）。其他资料参见附录Ａ。３．２粒体形态番茄环斑病毒粒体为等轴对称二十面体，直径２８ｎｍ。３．３基因组基因组由两条单链正义ＲＮＡ组成，ＲＮＡ１为８．２ｋｂ，ＲＮＡ２为７．３ｋｂ。多个分离物的基因组已被测序，各分离物之间序列同源性较低，根据依赖于ＲＮＡ的ＲＮＡ聚合酶编码区序列设计ＰＣＲ引物可检测烟草株系（Ｔｏｂａｃｃｏｓｔｒａｉｎ）、桃黄芽花叶株系（Ｐｅａｃｈｙｅｌｌｏｗｂｕｄｍｏｓａｉｃｓｔｒａｉｎ）、葡萄黄脉株系（Ｇｒａｐｅｙｅｌｌｏｗｖｅｉｎｓｔｒａｉｎ）及

4、多个ＴｏＲＳＶ分离物。４仪器设备、用具及试剂４．１仪器设备酶联检测仪、天平（感量，１／１００００ｇ）、ＰＣＲ仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、隔离温室、组织捣碎机、恒温水浴、低温冰箱等。４．２用具微量移液器（２．５、１０、２０、１００、２００、１０００）、酶联板、研钵等。μＬμＬμＬμＬμＬμＬ１犛犖／犜２６７０—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售４．３试剂酶联免疫吸附测定试剂（见附录Ｂ）、反转录聚合酶链式反应（ＲＴＰＣＲ）检测试剂（见附录Ｃ）。５样品制备５．１种子抽样按照ＳＮ／Ｔ２１２２的规定执行。将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，于２５℃生长并进行症

5、状观察。待长出３片～４片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（１０株为１组）并编号。５．２苗木按ＳＮ／Ｔ２１２２规定抽样。将苗木种植于隔离温室中，于２５℃生长并进行症状观察。有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法同５．１。６检测方法６．１酶联免疫吸附测定见附录Ｂ。６．２犚犜犘犆犚检测见附录Ｃ。６．３免疫电镜检测按照ＳＮ／Ｔ１８６０的规定执行。６．４生物学测定参见附录Ｄ。７结果判定６．１、６．２和６．３中的两种方法检测结果为阳性，即可判定检出番茄环斑病毒。酶联测定为阳性后，ＲＴＰＣＲ或免疫电镜检测结果为阳性可判定检出番茄环斑病毒。必要时可进行生物学测

6、定，并进行复验。８样品保存８．１样品保存经检验确定携带番茄环斑病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在４℃，病株在－２０℃或者－８０℃冰箱中保存，做好标记和登记工作。２犛犖／犜２６７０—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售８．２结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。酶联测定需有酶联极反应的原始数据，ＲＴＰＣＲ检测需有电泳结果图片，生物学测定需有鉴别寄主的症状照片，电镜观察需有病毒粒体照片。３犛犖／犜２６７０—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售附录犃（资料性附录）番茄环斑病毒相关资料犃

7、．１寄主范围ＴｏＲＳＶ的自然寄主有天竺葵属（犘犲犾犪狉犵狅狀犻狌犿ｓｐｐ．）、悬钩子属（犚狌犫狌狊ｓｐｐ．）、李属（犘狉狌狀狌狊ｓｐｐ．）和烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）等。在人工接种的情况下还可以侵染茄科、藜科、葫芦科、蔷薇科和豆科的１００多种植物。犃．２病害症状ＴｏＲＳＶ主要侵染多年生植物，在桃和其他李属植物上表现黄芽花叶症状；桃、樱桃和一些李属植物上表现茎部蚀损斑和退化症状；李树被ＴｏＲＳＶ侵染后产生褐色线条；ＴｏＲＳＶ侵染苹果树后嫁接部位上方膨大，接穗和砧木连接处的树皮异常增厚并呈海绵状，剖开树皮