番茄环斑病毒hc-rt-pcr-elisa检测

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1、维普资讯http://www.cqvip.com维普资讯http://www.cqvip.com2期赵文军等：番茄环斑病毒HC—RT-PCR-ELISA检测175苗木中截获，健康样品采自北京郊区。1．2引物及探针的设计根据ToRSVRNA1复制酶基因4个株系序列保守区，利用primer5．0设计引物及探针。TR-F：5'-gaegaagttatcaatggcagcg-3TR-R：5-tccgtccaatcacgcgaata-3探针：5DIG．1．3诱捕用PCR管的包被向杂交诱捕管(由动植物检疫实验所研制)

2、中加入100t&包被缓冲液(100mmol／L5端氨基化m．R，10mmol／LEDC，100mmol／L甲基咪唑pH7．0)，50℃密封温育5h。洗液(100mmol／LTris．HCIpH7．5，150mmol／LNaCI，0．1％Tween．20)洗管3次，然后用无菌水洗3次，4℃保存备用。1．4植物材料总RNA提取0．20．5g植物材料加液氮研磨至粉末，按lg：2mL的比例悬浮于RNA抽提液(1retool／LEDTA，1％SDS，0．2％巯基乙醇)，混匀，2倍体积的水饱和酚，氯仿，异戊醇(25：

3、24：1)抽提3次，无水乙醇沉淀，室温干燥，溶于100ttL无菌水中，一20℃保存。1．5总RNA的诱捕取酚，氯仿，异戊醇抽提1次后的上清液501O0~tL，加入到包被有反向引物的杂交诱捕管中，70℃5min，45℃保温30min，STE(20mmol／LTfis-CIpH8．0，100ramol／LNaCI，1mmollLEDTA)洗2次后直接在该管内作RT-PCR。1．6RT．PCR每管加入10×bufer5ttL(含25mmol／LMg2)，10mmol／LdNTPlttL，20btmol／LTR-

4、FlttL，20t,．mol／LTR．R1L，RNA2ttL，FastTaq酶2U，M．MLV200U，RNAsin40U，加水至50,uL，矿物油2滴。反转录及扩增条件为：48℃30min，94℃lOmin，94℃30s，54℃30s，72℃1min35个循环；72℃8min。1．7液相产物的电泳检测及固相产物的杂交检测取液相产物8ttL于lOOV电压下1．5％琼脂糖凝胶电泳40rain，EB染色，在紫外观察仪上观察结果。弃液相产物，新配变性液(0．2mol／LNaOH，0．1％Tween一20)洗管3

5、次，然后洗液(同上)洗3次，加入100ttL杂交液(50nmol／LDig．probe，5×SSC，0．1％Tween．20，0．5％BlocklingReagent)，50℃密封温育20rain，弃杂交液；0．5×SSC，0．1％Tween．20洗3次，每次浸3min；加入100ttL稀释的Anti．Dig．AP，50℃密封温育1h，洗液洗后100ttL显色液(0．1％PNPP，1mol／L二乙醇胺pH9．8，1retool／LMgCI：)，室温显色30min，用酶标仪在405nm下测019值。扣除空白

6、本底值，高于1．0为阳性，低于0．2为阴性。1．8测序验证液相产物回收后克隆到PMDI8．T载体上，送至上海基康生物技术公司测序，测序结果与GenBank中ToRSVRNA1复制酶基因序列比较。维普资讯http://www.cqvip.coml76微生物学报2结果2．1RT．PCR用苯酚法同时提取带毒番杏、樱桃、葡萄、苹果、烟草、桃6种材料总RNA后进行RT．PCR，电泳结果显示：在449bp左右有特异性扩增带，与预期扩增的449bp片段大小吻合。而在阳性苹果材料中却未扩增出预期条带，樱桃扩增条带模糊，结

7、果难以判定(见图1)。2．2RNA诱捕条件的优化在PTC．200PCR仪上同时进行不同温度梯度的RNA诱捕，STE洗后进行RT．PCR，电泳结果显示，在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃都能得到清晰的电泳条带，肉眼看不出差别(见图2)，本实验中，诱捕探针的Tm值为60℃，即使比Tm值低20℃时诱捕，亦扩增出清晰的电泳条带，说明在40℃～60℃之间的咖瑚姗瑚咖咖瑚姗瑚在任何温度，该探针都能得到好的诱捕效果。但诱捕温度与诱捕探针的Tm值相关，不同图1RT-PCR检测ToRSV探针的诱捕温度有所差别。在50

8、cI=温度下Fig．1ToRSVdetectionbyRT—PCR作诱捕时间实验，10～60min都能得到清晰电1．Newzealandspinach；2．Cherry；3．Grape泳条带(未附电泳照片)。4．Tobacco；5．Apple；6．Peach；7．Negative．2．3正反向引物浓度比对电泳和杂交信号的影响诱捕引物作为反向引物参与PCR扩增，液相中反向引物浓度低时有利于固相产物的扩增。正反向引物浓度比设为1：