具有生防功效的玉米秸秆降解复合菌系的构建

《具有生防功效的玉米秸秆降解复合菌系的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

第4O卷第4期西北农林科技大学学报(自然科学版)Vo1．40No．42012年4月JournalofNorthwestA&FUniversity(Nat．Sci．Ed．)Apr．2012网络出版时间：2012—03—2116：47网络出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／61具有生防功效的玉米秸秆降解复合菌系的构建马志远，罗晶，冯志珍，林星华，段军娜，安德荣(西北农林科技大学植物保护学院旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌712100)[摘要]【目的】构建具有生防功效的玉米秸秆降解复合菌系，以提高玉米秸秆的降解率，并有效防治植物病害。【方法】通过对可产芽孢的11株纤维素降解菌(X～X)、17株半纤维素降解菌(B～B)、19株木质素降解菌(M～M。)及1株生防菌(L)间亲和性的测定，构建复合菌系。测定复合菌系对玉米秸秆的降解能力，筛选出最优的复合菌系；通过16SrDNA序列分析，对组成最优复合菌系的菌株进行鉴定。以小麦种子发芽指数(GI)为指标，利用模拟堆肥试验研究最优复合菌系对玉米秸秆腐熟进程的影响；通过田间试验，研究最优复合菌系对番茄生长、产量的影响，并探讨其对番茄灰霉病的防治效果。【结果】通过亲和性试验初步构建了Z1(LMsXBz)、Z2(LM。XBs)、Z3(LM。X。B)和Z4(LMX。B。)4个复合菌系，其中复合菌系z1综合效果最好，其对玉米秸秆的降解率最高(45．9)。喷施复合菌系z1的发酵液可加快玉米秸秆腐熟进度，堆肥第25天时GI值超过85，玉米秸秆完全腐熟，腐熟进程较喷施清水的对照提前了4d。秸秆还田时喷施Z1发酵液，可促进番茄生长，提高番茄产量，并且对番茄灰霉病具有一定的防治效果(防治效果为27．92)。经l6SrDNA测序，鉴定组成复合菌系的L为类芽孢杆菌、X为枯草芽孢杆菌、M和B。为解淀粉芽孢杆菌。【结论】构建的复合菌系zl具有生防和降解秸秆的双重功效，且使用成本低、操作简单，具有潜在的应用价值。[关键词]秸秆降解；生防功效；芽孢杆菌；复合菌系[中图分类号]$182[文献标识码]A[文章编号]1671—9387(2012)04—011506ConstructionofcompositemicrobialsystemwithcapacityofstrawdegradationandbiocontrolefficacyMAZhi—yuan，LUOJing，FENGZhi—zhen，LINXing—hua，DUANJun—na，ANDe—rong(StateKeyLaboratoryofCropStressBiologyforAridAreas，CollegeofPlantProtection，NorthwestA&FUniversity，gangling，Shaanxi712100，China)Abstract：[Objective]Thesystemofbiocontrolstrainsofcornstrawdegradationcompoundwasbuilttoireprovetheutilizationofcornstrawdegradationandeffectivecontrolofplantdiseases．[Method]Inor—dertoconstructcompositemicrobialasystemwithcapacityofstrawdegradationandbiocontrolefficacy，weconstructedasystembyantagonistictestsamongllcellulose—degradingstrains(X1一X11)，17hemicellulose—degradingstrains(B1一B17)，19lignin—degradingstrains(Ml—MI9)andanantifungalstrain(L)，andtheyareallspore—forming．Theuseofaffinitydetermination，abilitytoantagonizetheactivityanddegradationofstrawcomprehensivedeterminationofthecompoundselectedthebeststrainsforcomposting，andfieldtri—alsforstrainsthatmakeuptheoptimalcompositestrainsweredeterminedby16SrDNAsequenceanaly—sis．Takewheatgerminationindex(GI)astheindex，thesimulatedteststudiedtheoptimalcomposting[收稿日期]2O1】一O923[基金项目]高等学校学科创新引智计划项目(B07049)；国家“863”计划项目“特殊微生物资源的研究和利用项目”(2007AA021503)；陕西省农业厅财政专项(k332o21oo6)[作者简介]马志远(1985一)，女，山西运域人，在读硕士，主要从事微生物资源利用研究。E—mail：sxczmazhiyuan@163．corn[通信作者]安德荣(1963一)，男，陕西大荔人，教授，博士生导师，主要从事微生物资源利用及植物病理研究。E—mail：anderong323@163．corn 116西北农林科技大学学报(自然科学版)第4O卷compoundstrainsofcornstrawrottenprocess．Throughfieldexperiment，theoptimalcompoundstrains，in—fluenceontomatoesgrowthandproductionwasstudiedtOinvestigatethecontroleffectoftomatogreymould．【Result1ThroughtheinitialcompatibilitytestfourcomplexstrainsofZl(LM5X4B2)，Z2(LM3X7B5)，Z3(LM3Xl0B2)andZ4(LM5X10Bl2)werebuilt，thenthebestonewithhighantifungalactivitywaschosenandstrawdegradationwaschosenforfurtherresearch．ResuhsshowedthattheZ1hadthebestcomprehensiveeffect；sprayingfermentationofZ1canspeeduptheprogressofstrawdecomposition，itsGIvaluewashigherthan85after25days，aftercompletematurity，itwas4daysearlierthanCK；sprayingfermentationofZ1instrawreturningcanpromotetomatogrowth，increaseyield，andpreventtomatograymoldtOsomedegrees，theinhibitoryratewas27．92．Zlpassedthesequencingof16SrDNA，thestrainofLwasidentifiedtobePaenibacillussp．ThestrainofX4wasidentifiedtobeBacillussubtilis．ThestrainofM5wasidentifiedtobeBacillusamyloliaue{aciens．ThestrainofB2wasidentifiedtobeBacillusamyloliauefaciens．[Conclusion]Theresultsshowedthatthecompositemicrobialsystemwhichweconstructedhasbifunctionalofbiocontrolanddegradingofstraw，costslow，andapplieseasily，whichhasgoodpotentialapplications．Keywords：strawdegradation；biocontrolefficacy；Bacillus；compositemicrobialsystem我国每年产农作物秸秆7亿t以上，若将其还1．1．2培养基蔗糖豆芽汁培养基：黄豆芽100g，田则不仅可培肥地力、改良土壤质量、解决秸秆焚烧蔗糖20．0g，蒸馏水1000mL，琼脂18．0g，pH造成的环境污染和安全隐患等问题，还有利于发展7．2。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20．0g，蒸有机农业，满足人们对有机农产品的需求口]。但秸馏水1000mL，琼脂18．0g，自然pH。基础培养秆直接还田存在分解慢、效果差、甚至病虫害严重等基：K2HPO33．0g，KH2PO41．0g，NH4NO30．5问题，这限制了其推广应用，而配施适当的秸秆降解g，Na2SO40．1g，MgSO4·7H2O0．01g，MnSO4·菌剂是解决该问题的有效方法。利用复合菌剂加快4H2O0．01g，FeS0·7H200．O1g，CaC120．005秸秆腐解已成为此方面研究的热点]。目前，在复g，蒸馏水1000mL，自然pH。合菌剂的构建方面，利用限制性继代培养法构建复1．2方法合菌剂的研究报道较多，如王伟东等利用该法构1．2．1复合茵系的构建(1)亲和性测定。在蔗建了WCS一6复合菌剂。但因限制性继代培养法具糖豆芽汁培养基平板上，利用平板对峙法测定不有重现性差及作用机理复杂等局限性，用该法构建同功能菌株间的亲和性。将相互间不具拮抗性的不的生防和降解秸秆效果较好的复合菌系还较少l5]。同功能的菌株用无菌水制成10cfu／mL的孢子悬液本研究通过对不同功效芽孢杆菌间亲和性和协同性或菌悬液后，等体积混合，初步构建成复合菌系。的测定，构建出具有生防与降解秸秆双功效的芽孢(2)发酵液活性测定。将初步构建的复合菌系杆菌复合菌系，并用堆肥试验和田间防效试验对其按40mL／L接种量接种于蔗糖豆芽汁液体培养基作用效果进行验证，以期得到对玉米秸秆降解率高中，37℃、180r／min培养2d后，于10000r／min离且能有效防治植物病害的复合菌系。心15min，取上清液用孔径0．22肛m微孔滤膜过滤，得培养滤液。吸取150I培养滤液，采用牛津1材料与方法杯法测定其对番茄灰霉病菌的抑菌活性，测量抑菌1．1材料圈直径并记录试验结果。试验重复3次，以接种1O1．1．1供试菌株11株纤维素降解菌(X～X)、mL／L生防菌L的发酵液为对照。17株半纤维素降解菌(B～B)、19株木质素降解(3)秸秆降解力测定。将玉米秸秆剪成大小约菌(M～M。)及1株生防菌(L)，均可产芽孢，由本为1cm。的小块，105℃烘至质量恒定，混合均匀，实验室从腐烂的秸秆及长期堆放秸秆的土壤中分离称取1Og左右加入含100mL灭菌基础培养基的筛选获得。番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)，由西500mL三角瓶中，再将初步构建的复合菌系按4O北农林科技大学植物保护学院植物病理实验室提mL／L的量接入，37℃、200r／min培养14d后过供。滤，将秸秆块用蒸馏水冲洗干净，再于105℃烘至质 第4期马志远，等：具有生防功效的玉米秸秆降解复合菌系的构建117量恒定，计算秸秆降解率[8]。试验重复3次，以接种(1)试验设计。试验设T1、T2和对照(CK)340mI／L无菌水为对照。秸秆降解率的计算公式个处理，T1填埋玉米秸秆喷施最优复合菌系的发酵如下：液，T2填埋玉米秸秆喷施清水，CK不填埋秸秆，秸秆降解率一(玉米秸秆降解前质量一培养后T1、T2处理堆肥方法同上。堆肥后种植冬春茬番玉米秸秆质量)／玉米秸秆降解前质量×100。茄，品种为“金棚一号”，9月下旬育苗，11月中旬定(4)复合菌系中各菌株的鉴定。参考文献[9—植，采用宽窄行小高垄种植，宽行0．7m，窄行0．511]，通过测定复合菌系中各菌株的16SrDNA基因m，株距0．3m，垄上覆膜。试验采用随机区组设序列对其进行鉴定。使用Axygen细菌基因组抽提计，每处理3行，重复3次。在病害调查前不进行灰试剂盒提取复合菌系中各菌株的总DNA，以其为模霉病的药物防治。其他管理措施按当地生产习惯统板，采用细菌16SrDNA的通用扩增引物(上游引物一操作。F27：5，_TACGGTACCTTGTTACGACT一3；下游(2)测定项目及方法。生长情况调查：在第1引物R1492：5r_CTGAGCCAGGATCAAACT一3)穗果结果期及第3穗果开始开花时(此时距定植的进行PCR扩增。PCR反应体系为25“L：DNA模时间为3个月左右)，在每小区对角线上5点取样，板1．0txI，F270．5L，R14920．5L，10×Buffer每点选5株番茄，做好标记，测量株高(茎基部到生2．5址I，MgC12(25mmot／L)1．5／,L，dNTP(10长点的长度，用卷尺测量)、茎粗(茎基部直径，用游mmol／L)0．5txL，Taq酶(2．5U／L)0．5L，标卡尺测量)。对标记的植株分区分次采收果实，统ddH2O18L。PCR反应程序：95℃预变性5min；计累积产量。95℃30S，55℃3OS，72oC90S，共35个循环；最病情调查：在盛果期，调查所有植株果实的发病后10℃放置。取PCR产物，经10g／L琼脂糖凝胶情况，统计病情指数。根据同一植株病果数P，参考电泳检测后送往生工生物工程(上海)有限公司进行孙军德等_】的标准对番茄灰霉病果实病情进行分序列测定，将测序结果用BIAST软件在GenBank级：0级P一0；1级P≤2；2级26。计算病情指数和防治效果：1．2．2复合菌系模拟堆肥试验试验在西北农林病情指数一×科技大学植物保护学院植物病理实验站进行。以种100；子发芽指数(GI)作为秸秆腐熟度的判定指标，用1．2．1节构建的最优复合菌系进行模拟堆肥试验。防治效果一鬣×试验设计参照文献[12]，在地面挖长1rn，宽0．6m，i00。深0．25In的沟，填埋玉米秸秆后，喷施稀释200倍1．3数据处理的最优复合菌系发酵液，直至湿润，覆25cm厚的数据均为3次重复的平均值，应用DPS软件对土，以喷施清水为对照(CK)。分别于试验的10，数据进行统计分析，采用Duncan新复极差法进行15，2O，25，27，29，31和33d，用土壤取样器在堆肥差异性检验。中进行5点取样，混合均匀备用。参考文献[13]，称取10g发酵料新鲜样品，加入100ml蒸馏水充分2结果与分析振荡，室温下浸提12h，吸取5mL浸提液置于垫有2．1玉米秸秆降解复合菌系的构建滤纸的9cm培养皿中，每个培养皿均匀放人10粒2．1．1亲和性测定通过对11株纤维素降解菌、饱满的小麦种子，于2O℃培养箱中培养，试验重复17株半纤维素降解菌、9株木质素降解菌及1株生3次，48h后测定发芽率和根长，计算GJ：防菌相互间亲和性的测定，初步构建了4个复合菌G一：对照平均发芽率×对照平均根长X100。系，分别为Z1(LMXB。)、Z2(LM。XB)、Z31．2．3复合菌系对番茄灰霉病菌的田间防效试验(LM3X10Bz)、Z4(LM5XloB12)。田间防效试验在陕西杨凌现代农业示范园区日光2．1．2发酵液活性测定由表1可知，通过亲和性温室大棚内进行，大棚为半拱形，东西走向，长80测定构建的4个复合菌系的无菌发酵液，对番茄灰m，宽7．5m。试验田地为6年番茄连作地，番茄灰霉病菌均有不同程度的拮抗活性，其中z4、Z1的抑霉病连续4年发生严重。菌圈直径均较大，接近21mm，且二者间无显著差 118西北农林科技大学学报(自然科学版)第4O卷异，但Z4、Z1与Z2、Z3间存在极显著差异(P<防菌L(P％0．01)。0．01)；4个复合菌系的抑菌圈直径均极显著小于生表1玉米秸秆降解复合菌系发酵液对番茄灰霉病菌的抑菌活性Table1AntimicrobialactivityofdifferentcompositemicrobialsystemsfermentationfiltratetoBotrytiscinerea注：同行数据后标不同小写字母者表示差异显著(P50时，堆肥已基菌(Paenibacillussp．，16SrDNA序列GenBank登本腐熟，基本没有植物毒性，而当G工>8O％时，堆肥录号为：JN639003)，X为枯草芽孢杆菌(Bacillus腐熟完全。本试验Z1复合菌系发酵液对小麦种子subtilis，16SrDNA序列GenBank登录号为：G的影响结果如表3所示。JN851149)，M为解淀粉芽孢杆菌(B．amyloli—表3最优玉米秸秆降解复合菌系Z1发酵液对小麦种子发芽指数的影响Table3OptimaldegradationofcompositestrainsofcornstoverfermentationbrothofchangeofGIduringcompostingCKZ1由表3可知，Z1和CK2个处理在堆肥过程中的株高、茎粗、产量与CK相比均无显著性差异，其小麦GJ值均呈逐渐增大趋势，表明随着堆肥时间茎粗略小于CK，说明将秸秆简单地直接还田对植的延长，肥料中对植物有毒害作用的物质被逐渐降株生长并没表现出促进作用；T1处理的株高、茎粗解；在测试期间，Z1处理的G一直大于CK，第25及产量分别为138．0cm、10．4mm和196．9kg，均天时，其GI为85．90，堆肥达到完全腐熟，而CK极显著高于其他2个处理，说明秸秆还田时添加Z1在第29天时堆肥才完全腐熟(GI为82．4)。可知能促进番茄生长，提高其产量。Z1处理的玉米秸秆较CK提前4天完全腐熟，说明2．3．2对番茄灰霉病的防治效果由表5可知，喷洒复合菌系z1可加快玉米秸秆的腐熟进程。T1和T2处理的病情指数均极显著低于CK(P<2．3最优玉米秸秆降解复合菌系Z1对大棚番茄生0．01)，表明其对番茄灰霉病均有一定的防治效果；长及灰霉病的影响T1处理对番茄灰霉病的防治效果最高，为27．92，2．3．1对番茄生长的影响由表4可知，T2处理说明秸秆还田时喷施复合菌系Z1发酵液对番茄灰 第4期马志远，等：具有生防功效的玉米秸秆降解复合菌系的构建l19霉病有较好的防治效果。表4最优玉米秸秆降解复合菌系Z1发酵液对番茄生长及产量的影响Table4Optimalcornstrawdegradationcompositestrainsoftomatogrowthandyieldcultureinfluence注：同列数据后标不同小写字母者表示差异显著(P<0．05)，标不同大写字母者表示差异极显著(P