miR-200c调控PIN1对喉癌Hep-2细胞生物学行为的影响

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1、分类号：R394单位代码：10159密级：公开学号：201520012硕士学位论文中文题目：miR-200c调控PIN1对喉癌Hep-2细胞生物学行为的影响英文题目：EffectofmiR-200cregulatingPIN1onthebiologicalbehaviorofHep-2cells论文作者：温行指导教师：李福才教授学科专业：遗传学完成时间：2018年2月中国医科大学硕士学位论文miR-200c调控PIN1对喉癌Hep-2细胞生物学行为的影响EffectofmiR-200cregulatingPIN1onthe

2、biologicalbehaviorofHep-2cells论文作者温行指导教师李福才教授申请学位理学硕士培养单位基础医学院一级学科生物学二级学科遗传学研究方向肿瘤细胞分子遗传学论文起止时间2017年9月—2018年2月论文完成时间2018年2月中国医科大学（辽宁）2018年2月中国医科大学硕士学位论文摘要前言：喉癌是头颈部常见恶性肿瘤之一，约95%为鳞状细胞癌，主要起源于喉粘膜上皮组织，喉鳞状细胞癌具有较高的死亡率和预后不良。目前，喉癌的发生发展及预后的众多分子机制尚不完全清楚。因此，探究喉癌发生发展的分子机制，寻找其诊

3、断及预后的生物分子标记物至关重要。miRNAs(microRNAs)是近年来发现的一类长度约为22个核苷酸的单链非编码RNA，通过特异性地结合靶基因mRNA的3'UTR而发挥作用。研究表明，miRNA既可以作为癌基因下调抑癌基因的活性，也可以作为抑癌基因下调癌基因的活性。miR-200c是miR-200家族（miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-429和miR-141）成员之一，位于12号染色体上。研究表明，miR-200c在多种类型的癌中对上皮-间充质细胞转化、细胞侵袭、转移、增殖、凋亡、自噬和抗

4、治疗过程都起到决定性的作用，而且在不同肿瘤中发挥不同的作用。目前，miR-200c是否参与喉癌的发生和发展尚不明确。前期工作中，我们发现过表达PIN1加剧了中心体扩增、细胞异常分裂和细胞迁移。通过Targetscan等软件预测发现，PIN1是miR-200c的潜在靶基因之一。本研究中，我们将应用相关分子生物学技术探究miR-200c对喉癌Hep-2细胞生物学行为的影响以及miR-200c是否通过PIN1在喉癌中发挥其生物学功能。材料与方法一、实验材料（一）喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系。（二）组织标本：取自中国医科大学第一附

5、属医院耳鼻喉科喉癌患者，全部病人术前未进行放化疗。标本保存于-80°C冰箱中，所有标本均经病理学检查确诊，并经医学伦理委员会批准及患者知情同意。（三）主要分子生物学相关试剂：RPMI1640培养基，Serana胎牛血清，RNAisoPlusRNA提取试剂，Takara定量试剂和RNA反转录试剂盒，SDS-PAGE凝胶试剂盒，兔抗PIN1单克隆抗体，鼠抗β-actin单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG，小鼠抗γ-Tubulin单克隆抗体，Dylight488标记抗小鼠IgG，TI

6、ANGEN质粒提取试剂盒，FITCAnnexinVApoptosisDetectionKitI等。I中国医科大学硕士学位论文二、实验方法1、荧光素酶报告基因活性检测2、细胞培养3、基因瞬时转染实验4、qRT-PCR检测5、WesternBlot检测6、CCK8检测7、Transwell小室检测法8、免疫荧光实验9、流式细胞术检测10、统计分析实验结果1、Real-timePCR结果显示，miR-200c在喉癌组织中的表达水平较癌旁组织增高（P<0.05），提示miR-200c参与喉癌的发生发展；此外，miR-200c在伴有

7、淋巴结转移的喉癌组织中的表达水平显著降低（P<0.05），提示miR-200c可能在肿瘤转移过程中发挥作用。转染miR-200cmimics和inhibitor后，Hep-2细胞中miR-200c的表达水平与对照组相比分别升高和降低（P<0.05），证明转染成功。2、CCK8检测结果显示，转染miR-200cmimics和miR-200cinhibitor后，Hep-2细胞的生长速率无明显差异（P>0.05）。3、Transwell实验结果显示，miR-200cmimics转染组穿过小室的Hep-2细胞数显著低于对照组，而

8、miR-200cinhibitor转染组中穿过小室的Hep-2细胞数多于对照组（P<0.05），提示miR-200c抑制Hep-2细胞的迁移。4、免疫荧光实验结果显示，miR-200cmimics转染组中心体异常扩增的细胞比例显著降低，miR-200cinhibitor转染组中心体异常扩增的细胞比例与对