miR-214-3p调控胶质细胞CTSB蛋白影响多巴胺能神经元活力的研究

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1、学校代码10459学号或申请号201512263045密级硕士学位论文MiR-214-3p调控胶质细胞CTSB蛋白影响多巴胺能神经元活力的研究作者姓名：冷利发导师姓名：陈辉副教授学科门类：理学专业名称：遗传学培养院系：基础医学院完成时间：2018年4月AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterTheRoleofmiR-214-3pAffectDopaminergicNeuronsbyRegulatingGlialCellsCTSBB

2、yLifaLengSupervisor:AssociateProf.HuiChenMedicalGeneticsSchoolofBasicMedicalSciencesApril2018miR-214-3p调控胶质细胞CTSB蛋白影响多巴胺能神经元活力的研究研究生：冷利发导师：陈辉副教授郑州大学基础医学院医学遗传与细胞生物学系河南郑州450001摘要研究背景与目的帕金森病（Parkinson'sdisease,PD）是一种常见的神经系统退行性疾病，平均发病年龄60岁，60岁以上发病率约1%，全球已有超5

3、00万患者。PD的主要临床症状有静止性震颤、运动迟缓、肌强直、步态和姿势平衡障碍等，发病后期可致残。PD的主要病理改变是中脑黑质部中多巴胺(DA)能神经元死亡。PD是由多种因素引起的疾病，它与遗传因素、环境因素、年龄、线粒体、自噬等相关，但其具体的病因及其机制目前还未完全明确，有待深入研究。目前临床上仍然没有有效的方法进行PD的早期诊断，因此研究PD的发病机制对于PD的诊断和治疗是至关重要的。炎症参与了PD的发病，而胶质细胞的组织蛋白酶B（CathepsinB,CTSB）参与了神经系统炎症的发生发展，所

4、以CTSB可能参与PD的发生发展。MicroRNAs（miRNAs）是一种内源性的长度21-23个核苷酸单链小分子RNA，它通过与靶基因信使RNA（mRNA）的3´非翻译区（3´UTR）结合诱导沉默复合体降解mRNA或阻碍其翻译，对真核细胞的基因表达、细胞发育分化和个体发育等多方面起调控作用。有研究发现PD患者血清中miR-214-3p的量显著下调，但是miR-214-3p在PD发生发展中的调控作用有待进一步阐明，其对PD发病机制的研究以及治疗方法的创新具有重要意义。通过生物信息学分析发现CTSB基因可

5、能是miR-214-3p的靶基因，而miR-214-3p调控CTSB蛋白与PD是否相关Ⅰ国内外鲜有报道。本研究以BV2细胞和U87MG细胞作为小胶质细胞与星形胶质细胞的代表，SH-SY5Y细胞是研究PD常用的细胞模型，再将miR-214-3p导入胶质细胞，以探索miR-214-3p是否调控胶质细胞CTSB蛋白降低多巴胺能神经元活力。本课题组在胶质细胞中过表达miR-214-3p，再使用药物1-甲基-4-苯基+吡啶离子（MPP）刺激，观察CTSB表达与miR-214-3p的变化情况，最后收集胶质细胞的条件

6、培养基（CM）去培养多巴胺能神经元，检测多巴胺能神经元活力。本项研究将阐明miR-214-3p调控胶质细胞CTSB蛋白对多巴胺能神经元活力的影响，为PD的临床治疗提供一定的实验支持。Ⅱ材料与方法第一部分miR-214-3p可结合CTSBmRNA的3´UTR1.重组GP-miRGLO-CTSB野生型质粒和GP-miRGLO-CTSB突变型质粒。2.CTSB的野生型质粒和突变型质粒分别与miR-214-3p的Mimics、NC、Inhibitor及InhibitorNC共转染HEK293T细胞进行荧光素酶报

7、告基因实验。3.将不同剂量的miR-214-3pMimics与相同剂量的野生型质粒共转染HEK293T细胞进行荧光素酶报告基因实验。4.统计学分析：所有数据均由SPSS21.0统计软件处理，定量资料应用均数±标准差（Mean±SD）表示；多组均数的比较使用单因素方差分析（ONEANOVA）,并利用LSD-t法进行组间比较；以α=0.05为显著性检验水准。第二部分miR-214-3p调控胶质细胞（小胶质细胞和星形胶质细胞）CTSB蛋白影响多巴胺能神经元活力的研究1.miR-214-3p的Mimics、NC

8、、Inhibitor及InhibitorNC分别转染BV2细胞和U87MG细胞后，内源性蛋白进行WesternBlotting。+2.MPP单独刺激BV2细胞和U87MG细胞后利用WesternBlotting和qRT-PCR分别检测蛋白和RNA的变化。+3.miR-214-3p与MPP共同作用BV2细胞和U87MG细胞后，用WesternBlotting和qRT-PCR检测蛋白和RNA的变化。+4.miR-214-3p与MPP共同作用BV