氟桂利嗪对黑质小胶质细胞及多巴胺能神经元免疫活性的影响及其相互之间的关系

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1、氟桂利嗪对黑质小胶质细胞及多巴胺能神经元免疫活性的影响及其相互之间关系前言帕金森病(Park谊so丑’sDise鹊e)是一种常见的神经系统锥体外系变性疾病，病理特征是中脑黑质多巴胺能神经元选择性的变性缺失，导致多巴胺减少。既往认为小胶质细胞激活现象是多巴胺能神经元损伤坏死的继发事件。最近研究表明慢性炎症反应介导的免疫损伤，尤其是小胶质细胞激活，在帕金森病中扮演重要的角色。而小胶质细胞的激活所产生的炎性细胞因子启动或加重了中脑黑质多巴胺神经元的损伤。为探讨黑质中小胶质细胞及多巴胺能神经元在帕金森病中的变化，本研究采用氟桂利嗪对大鼠进行系统性注射，出现与帕金森病非常相似的锥体外系运动征象

2、。我们通过氟桂利嗪对神经毒作用，采用免疫组化技术来观察黑质中小胶质细胞与多巴胺能神经元免疫活性的改变及其之间的关系，即小胶质细胞的激活促进黑质多巴胺能神经元的变性，为帕金森病的发病机制的研究提供了新的思路。材料与方法l组织切片的制备sD大鼠48只，体重1509～2009，用氟桂利嗪腹腔内注射。(nuIlarilze溶在1．5％酒石酸中)，对照组大鼠用1．5％酒酸注射(注射剂量与实验组相同)在不同时期(24小时的，1周的，1个月的)。用4％的多聚甲醛进行心脏灌流固定40分钟后取脑，用石蜡切片机制备切片，厚5肛m。免疫组化染色。2染色切片常规脱蜡至水，3％磁02孵育lO分钟，清除内源性过

3、氧化物酶的活性，蒸馏水洗3次。滴加正常山羊血清封闭液，室温30分钟。之后去掉·】·多余液体，不洗。再分别滴加适当稀释的一抗(TH、1：500，Ox一42、1：300，GFAP，l：200)空白对照组加0．1MPBSpH7．4，4℃过夜。PBS漂洗，滴加生物素标记的二抗(羊抗兔、羊抗小鼠)工作液，37℃30分钟，PBs漂洗。SABC液37℃30分钟，PBs漂洗。DAB作用10分钟。封片，镜检。结果1．Fz对黑质多巴胺能神经元免疫活性的影响正常多巴胺能神经元胞体呈星形，TH免疫染色阳性。注射氟桂利嗪24小时后观察结果显示：TH免疫活性几乎全部丧失，神经元胞体几乎不着色。一周后TH免疫活性

4、逐渐增加但此时活性也很弱，有少量阳性细胞，一个月后TH免疫活性逐渐恢复正常、阳性细胞数目增多，几乎恢复正常。2．Fz对黑质内小胶质细胞免疫活性的影响正常小胶质细胞胞体细长或椭圆，核小、扁平、染色深、胞体有细长突起，注射氟桂利嗪24小时后，黑质内有大量的被激活的小胶质细胞，与正常对照组相比表现为胞体增大，数目增多，一星期后小胶质细胞数量有所下降，一个月后小胶质细胞大小及数量逐渐恢复正常。3．Fz对黑质内星形胶质细胞免疫活性的影响正常星形胶质细胞胞体呈星形，核圆、较大、染色较浅。注射Fz后24小时，一个星期后及1个月后，实验组与正常对照组相比，基本元形态方面及数量的改变。讨论从研究的结果

5、可以看到：注射氟桂利嗪可导致黑质神经元损伤，并且在短时期内这种神经元损伤是可逆的。从形态学观察：注射氟桂利嗪24小时后，即有激活的小胶质细胞在黑质内出现，其形态更类似于吞噬细胞。而此时的黑质内的多巴胺能神经元的免疫活性几乎全部丧失。一周之后黑质内小胶质细胞数目开始减少，而此时的黑质内的多巴胺能神经元的免疫活性也正逐渐恢复，阳性细胞逐渐恢复。到一个月后黑质内的小胶质细胞及多巴胺能神经元的免疫活性基本恢复到正常水平。这说明了小胶质细胞的激活与黑质多巴胺能神经元的损害致密相关。早在19世纪初期Del—Hone-ga等人认为在黑质部比其他脑区小胶质细胞分布密度高。Kreutzbe唱认为小胶质

6、细胞是中枢神经系统病理事件的传感器。小胶质细胞作为中枢神经·2·系统免疫活性细胞，占神经细胞总数的10％左右，在中枢神经系统的免疫调节过程中发挥着核心作用，当许多微环境因子发生变化时小胶质细胞可迅速做出反应，形态上表现为从带有分支的静息状态转化为体积较大，胞体变圆，并具有吞噬作用的激活状态。在帕金森病患者脑中伴随着中脑黑质致密部多巴胺能神经元选择性丧失，被激活的小胶质细胞通过释放大量的致炎性因子(TNF—d，IL—lB)，N0活性氧化物(reactiveoxygenspecies，ROs)和花生四烯酸代谢产物等物质对中枢神经元产生毒性作用，而本实验的研究结果表明激活的小胶质细胞可能诱

7、导了黑质内多巴胺能神经元的变性，在研究中还可看到随着给大鼠注射射氟桂利嗪三种剂量的改变，在三个不同时期(24小时，一周，一个月)其小胶质细胞及多巴胺能神经元的数目改变及形态学变化及免疫活性也有着明显差异。结果表明随着剂量的增大，24小时内小胶质细胞激活越明显，多巴胺能神经元的免疫活性丧失越显著，一周及一个月后，多巴胺能神经元的免疫活性恢复也越差，这种神经元的毒性作用有剂量依赖性的特点，进一步说明了神经元的损伤变性可能还与氟桂利嗪产生的神经毒性相关，且在短时