功能高分子基因和蛋白质载体的筛选及构效关系研究

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1、2018届研究生博士学位论文分类号：学校代码：10269密级：学号：52151300017華東師範大學EastChinaNormalUniversity博士学位论文DOCTOR’SDISSERTATION论文题目：功能高分子基因和蛋白质载体的筛选及构效关系研究院系：生命科学学院专业：生物化学与分子生物学研究方向：生物材料指导教师：程义云教授学位申请人：吕佳2018年5月完成i华东师范大学博士学位论文Dissertationof2018UniversityCode:10269ForPh.D.DegreeStudentID:52151300017EastC

2、hinaNormalUniversityScreeningandstructure-activityrelationshipoffunctionalpolymersforgeneandproteindeliveryDepartment:SchoolofLifeSciencesMajor:BiochemistryandMolecularBiologyResearchdirection:BiomaterialsSupervisor:ProfessorYiyunChengGraduatestudent:JiaLvMay2018ii华东师范大学博士学位论文ii

3、i华东师范大学博士学位论文吕佳博士学位论文答辩委员会成员名单姓名职称单位备注刘润辉教授华东理工大学主席殷黎晨教授苏州大学平渊教授浙江大学林开利教授上海交通大学医学院李乙文教授四川大学iv华东师范大学博士学位论文摘要阳离子高分子是一类广泛使用的非病毒生物大分子递送载体，具有水溶性好、组织穿透能力强、结构可控、易于合成等优点。然而阳离子高分子作为生物大分子递送载体在应用过程中存在转染效率不高、细胞毒性大等问题。为了解决这一问题，研究者在阳离子高分子表面做了大量的功能化改性，这在一定程度上解决了阳离子高分子递送效率及毒性方面的问题。但是由于这些研究相对独立，

4、所基于的高分子骨架及细胞种类各不相同，无法使研究者形成对修饰基团结构、数量与其生物大分子递送效率之间关系的统一认识，从而无法有效指导生物大分子递送载体的设计与研究。因此，生物大分子递送载体的理性设计仍然面临很大挑战。针对上述问题，本文拟应用库的策略，即构建功能化修饰的阳离子高分子库，通过对库中载体的生物大分子递送效率进行筛选，了解修饰基团结构与其递送效率之间的关系，从而得出构效关系理论，以便更好地指导生物大分子递送载体的理性设计。本论文具体研究方法及结论如下：（1）功能化修饰的树形高分子库筛选高效的siRNA递送载体。在树形高分子表面修饰碳氢烷基链、碳

5、氟烷基链、芳香类化合物、杂环类化合物、氨基酸等功能基团，得到功能化修饰的高分子载体库。通过对库中材料的siRNA递送效率进行筛选，得到10种高效、普适、低毒的siRNA递送载体，其中效率最高的材料为在树形高分子表面修饰99条三苯基膦的产物E9-2，在难转的干细胞中亦表现出优异的基因敲除效率。结构与功能关系的研究发现适度的疏水性（氟链或芳香环）修饰或疏水基团与一些功能原子（氟或溴）或基团（硼酸或胍基）的组合可以极大地提高树形高分子的siRNA递送效率。（2）含氟高分子库筛选高效、安全的蛋白质递送载体。树形高分子表面修饰不同结构的含氟小分子化合物，得到氟化

6、修饰的高分子载体库。通过对库中所有载体的蛋白质递送效率进行筛选，发现随着氟烷基链长度的增加，载体的蛋白质递送效率表现出先增高后降低的趋势。其中在树形高分子表面连接71条C8F8链的产物表现出最高的蛋白质递送效率。该产物可以对不同分子量、不同带电情I华东师范大学博士学位论文况的蛋白质实现高效递送，克服了蛋白质递送中的电荷局限性。当将该产物中的氟原子用氢原子取代后，载体的递送效率显著下降，说明了该体系中氟原子对于蛋白质递送的必要性。氟烷基链对阳离子高分子递送效率的促进作用主要归功于细胞内吞和内涵体逃逸过程中表现出的氟效应。继续增加高分子表面氟烷基链的修饰度

7、或氟链的长度可以得到更高的蛋白质递送效率，但产物的溶解度也会随之降低。（3）疏水胍基化合物修饰的阳离子高分子库筛选高效、安全的蛋白质递送载体。在充分认识到疏水基团和功能基团的结合能够极大地提高阳离子高分子的基因递送效率之后，我们将功能基团胍基与不同的疏水基团整合，得到含不同长度碳链及苯环的多功能基团，并将其修饰在阳离子高分子上，获得了疏水胍基化合物修饰的高分子载体库。通过对库中化合物的蛋白质转染效率进行筛选发现，胍基与苯环的组合能够最大限度地提高阳离子高分子的蛋白质转染效率。其效率可以达到商业化蛋白质转染试剂Pulsin的10倍以上。我们将筛选得到对胍

8、基苯甲酸基团修饰在不同种类不同分子量的阳离子高分子上，发现其都极大地提高了高分子材料的蛋白质递