茶多酚单体对黄曲霉产毒的抑制及机理研究

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1、论文分类号：１０７０８：１学校代码学号：１５０４０２７浼蚤＃铉ＡｆＳＨＡＡＮＸＩＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＳＣＨＩＥＮＣＥ＆ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ硕士学位论文Ｔｈｅｓ＇ｉｓｆｏｒＭａｓｔｅｒｓＤｅｇｒｅｅ茶鎌轉麵删糊ＥｉＥｌｒｔ．＊论文答辩曰期：２０１８年５月義｜——ＶＪＩＢＩ申请工学硕士学位论文论文题目：茶多酚单体对黄曲霉产毒的抑制作用及机理研究学科门类：工学一级学科：食品科学与工程培养单位：食品与生物工程学院硕士生：郭芮导师：宋宏新教授徐丹博士2018年5月Inh

2、ibitionandMechanismofTeaPolyphenolMonomersonAFB1ProductionbyAspergillusflavusAThesisSubmittedtoShaanxiUniversityofScienceandTechnologyinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofEngineeringScienceByRuiGuoSupervisor:Prof.Hong-xinSongDr.DanXuMay2018茶多酚单体对黄曲霉产

3、毒的抑制作用及机理研究摘要黄曲霉毒素B1（AFB1）是由黄曲霉等真菌产生的一种强致癌性真菌毒素，ROS介导的氧化应激是其合成的先决条件，抗氧化剂能有效抑制毒素合成。前期研究发现茶多酚能显著降低黄曲霉胞内氧化压力，抑制AFB1的生物合成，但作用机理尚不明确。因此，本文首先考察了五种茶多酚单体：儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对AFB1合成的抑制效果，明确了起主要抑制作用的单体，并探究了单体空间结构与抑制产毒能力之间的关系；然后通过RNA-Seq技术研

4、究了该单体对黄曲霉基因转录水平的影响，从中挖掘出AFB1合成途径、氧化应激信号传导途径中响应该单体作用的关键基因；最后从基因转录、蛋白表达及修饰、AFB1合成代谢途径等方面分析茶多酚单体对AFB1合成的抑制作用，阐明茶多酚抑制AFB1合成的分子机制，主要结果如下：1.五种茶多酚主要单体对黄曲霉生长无明显抑制作用，未对菌丝体结构造成破坏，但可有效抑制AFB1的合成，抑制率最高可达92.00%（2mg/mLEGCG），抑制作用由大到小为：EGCG＞EC＞ECG＞EGC＞C，表明EGCG是抑制AFB1合成的主要单体。为进一步研究单体空间结构与抑

5、制AFB1合成的关系，采用Gaussian09软件中DFT计算方法在B3LYP/6-31G（d，p）基组下计算了五种茶多酚单体的键长键角、酚羟基氢带电荷数、前线轨道能量等参数。发现茶多酚单体化合物C9位羟基成酯后抑制AFB1合成能力增强；化合物酚羟基数越多，酚羟基氢带正电荷数越大，则茶多酚单体的抗氧化活性越高，且单体抑制AFB1合成的能力越强，说明茶多酚单体清除自由基的能力影响其抑制AFB1合成的效果；分子的LUMO轨道能级越小，抑制AFB1合成能力越强，说明茶多酚单体抑制AFB1时以清除电子为主。2.对黄曲霉转录组数据进行分析，发现EG

6、CG使黄曲霉927个基因发生了显著性差异表达（p＜0.05），其中496个基因下调，431个基因上调，上调基因主要参与抗氧化酶及脂质的合成，下调基因主要涉及细胞受氧化压力等刺激所激活的信号传导途径。经EGCG处理后，AFB1合成所需前期基因（aflA、aflC、aflE）、中期基因aflJ及毒素合成的特异性调控因子基因aflR均发生了下调；且氧化应激介导的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号I途径中MAP激酶激酶Mkk2、MAP激酶SakA及其下游转录因子AtfA的基因转录水平也发生了下调。推测EGCG通过MAPK途径抑制AFB1合成基因簇

7、中aflA、aflC、aflE、aflJ、aflR的表达，减少AFB1的合成。3.基于黄曲霉转录组的数据分析，进一步研究了EGCG对黄曲霉胞内ROS水平、细胞质与细胞核中激酶SakA蛋白表达及磷酸化水平、转录因子基因atfA及AFB1合成基因簇中aflA、aflC、aflE、aflJ、aflR的转录水平、AFB1及其前体物质NOR合成的影响。结果显示：EGCG能显著降低黄曲霉胞内ROS水平，缓解菌体胞内氧化压力；抑制ROS对SakA的激活，使细胞质与细胞核中该激酶磷酸化水平分别下降了38.92%和78.64%；下调atfA、aflA、af

8、lC、aflE、aflJ、aflR的转录水平，使AFB1前体物质NOR的合成量减少70.91%，进而阻断了AFB1的合成（抑制率为87.50%）。上述结果表明EGCG通过降低胞内ROS含量，抑