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1、医学论文：人白细胞介素12双亚基共表达pVAX1-IRES-hIL12载体的构建与表达摘要：目的构建下游可以共表达人白细胞介素12(hIL12)双亚基的双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES-hIL12。方法通过搭桥PCR获得人白细胞介素12P35及P40双亚基的融合基因P35-F2A-P40，插入DNA疫苗载体pVAX1-IRES的下游，瞬时转染293-T细胞，ELISA检测融合基因的表达。结果酶切鉴定和序列分析表明融合基因与设计完全一致，融合基因在体外细胞培养液检测中获得分泌表达。结论该载体的成功构建可以为肿瘤基因疫苗研制提供免疫增效载体。关键词：白细胞介素12；基因融合；
2、真核细胞；IRES 文献标识码：A 文章编号：1005-1139(2010)06-0600-04Constructionofhumaninterleukin12doublesubunitsco-expressingpVAX1-IRES-hIL12vectoranditsexpressionWANGWei1,2,GAOJiang-ping2,YANJin-qi1,XIAOYi1,2,RENJie2,WANGYu1,JIANGLe1,YUJi-yun11InstituteofBasicMedicalSciences,AcademyofMilitaryMedicalSciences,
3、Beijing100850,China;2DepartmentofUrology,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,ChinaCorrespondingauthor:YUJi-yun.Email:yujyun@126.comAbstract:ObjectiveToconstructthebicistroniceucaryoticexpressionvectorofhumaninterleukin12(hIL12)pVAX1-IRES-hIL12co-expressingthehIL12doublesubunits.MethodsThe
4、fusiongeneP35-F2A-P40,amplifiedbyoverlapextensionPCR,wasinsertedintothedownstreamoftheeukaryoticexpressionvectorpVAX1-IRES.ThentherecombinantplasmidpVAX1-IRES-hIL12wastransfectedto293Tcells,anditsexpressionwasdetectedbyELISA.ResultsEnzymedigestionandsequenceanalysisshowedthatthebicistroniceuc
5、aryoticexpressionvectorpVAX1-IRES-hIL12wassuccessfullyconstructed.TheexpressionofrecombinantplasmidwasdetectedbyELISA,suggestingthatthefusiongenescanexpressin293Tcells.ConclusionSuccessfulconstructionofthevectorcanprovideaneffectiveimmunetoolforthedevelopmentofanti-tumorvaccine.Keywords:hIL12
6、;GeneFusion;EukaryoticCells;IRESIL12是肿瘤和病毒免疫基因治疗的主要候选基因。由于hIL12是由分子量为40kD(P40)和35kD(P35)两个亚基构成的异源二聚体分子，发挥生物学效应需要P40和P35的共同作用，本实验研究将P40和P35两个亚基用自体切割肽F2A序列串联连接后克隆入真核表达载体pVAX1-IRES中，F2A由蛋白切割酶furin识别位点及来源于手足口病毒的2A序列连接构成[1]，构建成功的双亚基共表达质粒pVAX1-IRES-hIL12能够更接近hIL12基因的生物学作用模式，显著提高了hIL12的分泌型表达。因此，我们在本
7、研究室已构建的双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES的基础上，将人IL12融合基因插入载体IRES序列的下游，构建一个下游可以表达免疫协同增效分子的双顺反子真核表达载体pVAX1-IRES-hIL12，在基因疫苗中作为免疫佐剂发挥作用。材料和方法1材料 人胚肾细胞293T和大肠杆菌DH5α由本研究室保存；包含人IL12P35亚基的质粒pCMV6-XL4-P35和pCMV6-XL4-P40购于ORIGEN公司，真核表达载体PCI-GPI-sig-F2A及pVAX1-IRES为本研
