qβ rna 复制酶中亚基的共表达对β亚基溶解性的影响

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1、!!卷"期微生物学报&’()!!0’)"#$$!年%#月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$*+,+-.+/#$$!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"#$复制酶中亚基的共表达对!亚基溶解性的影响王栋（江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡#%!$G"）摘要：在体外I0J和蛋白质合成及自复制系统的研究中，K!I0J复制酶作为以I0J为模板的I0J聚合酶，是比较重要的应用酶种之一。该酶由!个亚基组成，其中只有!亚基是由病毒基因编码，

2、而其他G个亚基都是宿主蛋白。利用普通表达载体合成K!复制酶时，得到的!亚基几乎都是不溶性蛋白，从而影响了K!复制酶的活性和产率。为尝试提高!亚基的溶解性，构建含有!亚基基因的表达质粒LMJ*GG:/+L，同时利用L<4#%（7N）为表达载体表达其他G个亚基进行共表达研究。不同亚基组合的共表达结果通过O*O:PJQ<分析表明，当!亚基与<6:4F:4C亚基共表达时，溶解度有一定的提高，而且可溶性部分也具有复制酶活性。通过调节共表达诱导物浓度，相对增强可溶性!亚基的表达，可溶性K!复制酶酶量得到相应的提高。关键词：K!复制酶，共表达，!亚基，溶解性中图

3、分类号：K29文献标识码：J文章编号：$$$%:"#$1（#$$!）$":$29$:$;K!复制酶最初是来源于K!噬菌体的以I0J<6:4C的胞内含量比较低，而亚基<6:4C和<6:4F对［%，#］［%;，%"］为模板的I0J聚合酶，现在常用于体外I0J的于K复制酶的合成和功能又具有重要作用，!!［G，!］复制及分子进化、无细胞蛋白质分子的合成以亚基单独表达时可能会引起其他亚基量的相对不［;R9］及自复制系统的构建研究。该复制酶由!个亚足，从而影响K!复制酶全酶的合成及其活性。因基组成，分别为"，!，#和$亚基，其中只有!亚基此利用!亚基与其他亚基

4、共表达可以了解是否宿主是由病毒基因编码，大小约为";S*，其他G个亚基亚基的缺乏是引起K!复制酶不溶性的主要因素，都是宿主蛋白，通常与蛋白质合成有关，分别为核糖进而了解!亚基与其他G个亚基的共表达是否有助［%"］体蛋白O%（"），蛋白质合成延长因子<6:4F（#）和于可溶性K!复制酶的形成。6FS7@’等研究发［%］<6:4C（$），各亚基以等摩尔比构成完整的复制酶。现，在真核无细胞体系中，<6:4C和<6:4F作为融合随着K!复制酶研究的深入，该酶除了在体外蛋白表达对于K!复制酶的活性具有重要作用。其I0J和蛋白质分子的合成及构建自复制系统研究他

5、利用共表达来提高K!复制酶溶解性和活性的研领域具有重要理论研究价值，在I0J的扩增和基因究未见报道。为此，本文对K!复制酶!亚基与其他［1，%$］检测等方面也有重要应用，对于纯化的K复亚基的共表达进行了探索，研究提高可溶性复制酶!制酶的需求正不断增加。但K复制酶的产量仍较生产的可能性，对于利用亚基的共表达提高多亚基!为有限，为此，许多研究者利用噬菌体、表达质粒等酶的溶解性进行了尝试。分子生物学手段对K复制酶的制备和纯化进行了!［%%R%!］%材料和方法大量的研究工作，然而提供具有活性的纯K!复制酶仍难以满足需要，所用方法也不够简便迅速，%&%菌种和

6、培养基制备过程中还存在一些问题。利用质粒对K复制大肠杆菌（!"#$%&’#$’(#)*’）MT#%（*OM（/M:-M:）A7(>,-（*

7、，浙江绍兴人，江南大学生物工程学院助理研究员，在职博士研究生，主要从事微生物和酶工程研究工作。4+(5678：9":;%$:;9"!%%#；<:-7=(：>?7@ABCDEF)+>F),@，>?7@A%#G!B%"GH,’-收稿日期：#$$!:$!:#"，修回日期：#$$!:$9:##T期王栋：3!G75复制酶中亚基的共表达对!亚基溶解性的影响PM#其他实验菌株，大肠杆菌!"#$%&’(()*+’和为浓度$J.S的-)阿拉伯糖。当菌体生长至细胞密,-.（#/01）&’02)*+’由大阪大学应用生物工学系酶度达到,-T$$$JD时，加入诱导物，继续培

8、养1U。取工程实验室提供。DR-培养液离心收集细胞，再悬浮于D$$"-缓冲液!"#主要试剂中［#$RRB?&-2*9O)V