京尼平对肾癌细胞的抑制作用及对解偶联蛋白、线粒体解偶联影响的机制研究

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1、贵阳医学院2010届硕士研究生论文《中国图书资料分类法》分类号：R737.11单位代码：10660学号：S100410京尼平对肾癌细胞的抑制作用及对解偶联蛋白2、线粒体解偶联影响的机制研究贵阳医学院2013届临床医学硕士专业学位材料(临床论文部分)研究生：王楠导年专师：级：业：谷江教授2010级外科学（泌外）2013年3月13日贵阳医学院2010届硕士研究生论文目录摘要„„„„„„„„„„„„„„页码1略缩词表„„„„„„„„„„„„„页码1前言„„„„„„„„„„„„„„页码2材料与方法„„„„„„„„„„„„页码2结讨果„„„„„„„„„„„

2、„„„页码4论„„„„„„„„„„„„„„页码14参考文献„„„„„„„„„„„„„页码15致谢„„„„„„„„„„„„„„页码16英文摘要„„„„„„„„„„„„„页码16论文原创性声明„„„„„„„„„„页码18综述„„„„„„„„„„„„„„页码18附：临床能力考核有关材料：临床轮转考核表(按时间顺序)学术活动情况表(按时间顺序)临床能力考试及学位答辩情况表贵阳医学院2010届硕士研究生论文京尼平对肾癌细胞的抑制作用及对解偶联蛋白2、线粒体解偶联影响的机制研究外科学（泌外），研究生：王楠，导师：谷江摘要：目的：研究京尼平对肾癌细胞株GRC-1的抑制作用,对U

3、CP2和线粒体能量代谢相关指标的影响及其作用机制。方法：使用不同剂量京尼平干预GRC-1后,MTT及流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况；PCR和ELISA法检测UCP2的表达；荧光分光光度计检测线粒体通透性转运孔(MPTP)开放度、线粒体膜电位(Δψm)的变化；荧光探针检测细胞内活性氧簇(ROS)、Ca2+的变化。结果：京尼平可提高GRC-1细胞的抑制率、凋亡率和MPTP开放度(P<0.05)；可使UCP2的表达及Δψm数值降低(P<0.05)；能提高细胞内Ca2+和ROS水平(P<0.05),以上作用均与京尼平浓度呈正相关。结论：京尼平可有效抑制肾癌细胞的生长,该抑制

4、作用可能与UCP2所调节的解偶联和ROS、Ca2+沉积有关。关键词：京尼平；线粒体解偶联蛋白2；肾癌;解偶联缩略词表英文缩写UCP2PCRROSMPTPSPSS英文全称Uncouplingprotein2PolymeraseChainReactionReactiveoxygenspeciesMitochondrialpermeabilitytransitionporeStatisticalProductandServiceSolutions1中文全称解偶联蛋白2聚合酶链反应活性氧分子线粒体通透性转换孔统计产品与服务解决方案贵阳医学院2010届硕士研究生论文1.前言

5、肾癌细胞较正常肾小管上皮细胞生长更为快速、同时具备侵袭性、异质性等特性[1],需要更多的能量支持。因此,从细胞的能量中心线粒体着手,对肾癌进行治疗及机制的研究显得较有目的性。UCP2定位于线粒体内膜,与多种肿瘤的发生发展相关[2-4]。其可以通过调控质子的无效渗漏引起解偶联相关指标：线粒体膜电位(ΔΨm)、线粒体膜通道转运孔(MPTP)开放程度和活性氧簇(ROS)、钙离子水平的改变,维持细胞内稳态,调节代谢,避免细胞发生凋亡[2-3],直接或间接调控线粒体能量的生成[5]。因此,选择UCP2作为本研究的靶点。京尼平作为栀子等我国多产中药的提纯物,是UCP2的特异性阻断

6、剂[6]。故本研究将UCP2和京尼平作为研究对象,探讨京尼平对肾癌细胞的抑制作用及UCP2是否参与其作用机制。2.材料与方法：2.1细胞干预及分组人类肾癌细胞株GRC-1购自美国ATCC细胞库,于5%CO2、37℃条件下培养,培养基为含有热灭活10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素的RPMI1640培养基。细胞种板后,汇合度达70-80%更换无血清培养基,分别使用三种浓度(40μmol/L、80μmol/L、120μmol/L)的京尼平干预细胞,并相应分为低、中、高剂量组。2.2MTT法检测京尼平对细胞生长的影响细胞接种于96孔板,104个/孔,培养24h后使用三种浓度京

7、尼平干预48h,每组复孔5个。小心吸取孔内培养基,每孔加入80μl无血清培养基和20μlMTT溶液(5μg/L,sigma公司),孵育4h。小心吸取孔内液体,每孔加入150μl二甲亚砜，摇床震荡10min,待蓝紫色结晶充分溶解后,用酶标仪检测490nm处的OD值,并根据公式计算：细胞抑制率(%)=[(对照组OD值-调零孔OD值)-(干预组OD值-调零孔OD值)]/(对照组OD值-调零孔OD值)×100%。2.3流式细胞术检测细胞凋亡京尼平干预48h后,用不含EDTA的胰酶消化后离心收集细胞,每样本细胞数约为2.5×106个,弃去培养基,使用PBS洗涤