表达hpv16 l1、l2和e7蛋白的非复制重组痘苗病毒的构建的论文

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1、表达HPV16L1、L2和E7蛋白的非复制重组痘苗病毒的构建的论文【摘要】目的构建防治宫颈癌的表达人乳头瘤病毒16型（hpv16）l1，l2e7蛋白的非复制重组痘苗病毒疫苗株。方法以痘苗病毒为载体，利用同源重组技术筛选共表达hpv16l1，l2e7蛋白的重组痘苗病毒，用pcr和westernblot技术进行鉴定。结果该病毒在鸡胚成纤维细胞（cef）中连续传代15代，经pcr检测证实病毒基因组中有hpv16l1，l2e7目的基因插入，westernblot检测证实病毒可以稳定表达l1和l2e7蛋白。结论构建的病毒ntvjl1l2e7可以在真核细

2、胞中表达hpv16l1和l2e7蛋白，可以作为治疗和预防hpv16相关疾病的候选疫苗。【关键词】人乳头瘤病毒痘苗病毒疫苗大量的研究证实，高危型人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus,hpv）的慢性持续感染是宫颈癌及其癌前病变发生的主要病因［1，2］。尤其是hpv16，18型，占所有病例的70％以上［3，4］。研制宫颈癌预防和治疗性疫苗是目前防治hpv相关疾病的途径。本研究利用非复制痘苗病毒为载体，成功构建了表达hpv16l1、l2和e7蛋白的非复制重组痘苗病毒，目的在于获得用于预防和治疗hpv相关疾病的疫苗。1材料和方法1．1质

3、粒pneojsd7.5l1h6l2e7：痘苗病毒表达质粒。Www.11665.COM含反向串联的痘苗病毒天坛株启动子7.5k和h6，其中7.5k启动子表达hpv16l1基因，h6启动子表达hpv16l2e7融合基因，其侧翼序列为痘苗病毒天坛株的tk基因。由中国疾病预防控制中心病毒病研究所病毒应急技术中心构建并保存。1．2病毒ntvjlac痘苗病毒：为tk区表达大肠杆菌β半乳糖苷酶基因lacz的非复制痘苗病毒，由中国疾病预防控制中心病毒病研究所病毒应急技术中心构建［5］、保存。ntvjtk+δck：为缺失了ck区的非复制痘苗病毒。由中国疾病预

4、防控制中心病毒病研究所病毒应急技术中心构建、保存。1．3细胞株鸡胚成纤维细胞（chickenembryofibroblast，cef）：用8～9日龄无鸡白血病病毒的鸡胚，按常规方法制备。1．4主要试剂hpv16l1、l2、e7多克隆抗体为中国疾病预防控制中心病毒病研究所病毒应急技术中心制备，为豚鼠多抗；辣根过氧化物酶（hrp）标记的山羊抗小鼠igg购自北京中山生物技术有限公司；转染用lipofectin为gibco公司产品；细胞培养用琼脂（agarnobel），为difgo（usa）产品；xgal，为figo公司产品；化学发光检测试剂盒，为

5、pierce公司产品；pcr过程中的各种工具酶和dna分子量标准主要购自大连takara公司；hpv16l1全基因上下游引物、l2上游引物及e7下游引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。1．5病毒的构建、筛选和纯化选择培养24～36h、80%～90%成片的鸡胚成纤维细胞，感染0.01～0.1pfu/ml的亲代痘苗病毒ntvjlacz，将pneojsd7.5l1h6l2e7痘苗病毒表达质粒用脂质体转染试剂lipofectin转染细胞（具体操作按gibco公司试剂盒使用说明进行），33℃继续培养60～72h后收获细胞，冻融3次，重组病毒上清液

6、用于重组病毒的筛选。采用g418neo及蓝/白斑双重筛选方法筛选重组病毒。已长成单层的cef细胞感染重组液病毒，在含g418的生长液中继续培养2代，获得富含neo基因的重组病毒。然后换用不含g418的生长液中继续培养1～3代，脱去neo基因。将收获的病毒液进行连续10倍稀释后感染cef细胞，33℃培养60～72h，选择病毒斑密度适宜的培养瓶进行铺斑。铺斑液为含200μg/mlxgal，50μg/ml中性红，5.2%琼脂（agarnoble，difco）的维持液。等出现白斑后进行随机挑选单斑。将挑出的白色病毒单斑移至1ml鸡胚成纤维细胞维持

7、液中，-70℃冻融3次。取适量病毒液稀释后接种鸡胚成纤维细胞，培养60～72h，选择合适稀释度进行铺斑，随机挑选孤立的白斑。如此连续单斑纯化5～8次，将纯化获得的单斑重组病毒感染鸡胚成纤维细胞进行扩增，直到获得所需滴度的重组病毒。分装至冻存管中，-70℃保存。1．6pcr法检测重组病毒中的目的基因重组痘苗病毒感染鸡胚成纤维细胞，提取其中重组病毒的dna，溶于三蒸水中备用。利用hpv16l1全基因的上下游引物（lf，lr），用pcr的方法来扩增重组痘苗病毒中的l1基因，用hpv16l2的上游引物和e7的下游引物来扩增重组痘苗病毒中融合基因l2e

8、7。同时设阳性质粒和阴性病毒对照。用0.8％的琼脂糖凝胶电泳来鉴定扩增产物的大小，根据扩增产物的大小来判断所重组的痘苗病毒是否含有目的基因。1．7westernbl