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1、构建含有4种外源基因的重组痘苗病毒 疫苗在传染病防控领域发挥着至关重要的作用,极大程度降低了传染病的发病率和死亡率。可通过接种疫苗来抵御病原体入侵以预防疾病,如天花的根除、小儿麻痹以及甲乙型肝炎的控制等。但是随着疫苗种类的不断增多,不同疫苗之间存在接种禁忌,多个疫苗接种的程序繁琐等问题也随之引发。不仅造成资源浪费,而且增加感染机率,同时大量疫苗的储备及运输也提高了成本,由此给疫苗的使用和疾病的预防带来诸多不便。为解决上述问题,构建多联多价疫苗具有重要意义。目前,我国的麻疹-腮腺炎二联苗,麻疹-风疹二联疫苗以及麻疹-腮腺炎-风疹三联疫苗已成功研制[1-2]。对于烈性传染病,加强预
2、防控制方案尤为重要。黄热病、汉坦病、克里米亚刚果出血热和炭疽等均是由病毒或细菌引起的以发热、出血、高病死率为特征的烈性传染病,对社会及人类健康具有极大的威胁。 痘苗病毒作为疫苗最早曾用于天花的防控,应用历史悠久。且痘苗病毒因其基因组容量大,含有大量的非必需基因,可载入大片段的外源基因等特点一直被广泛应用于构建基因工程病毒载体疫苗,如艾滋病[3]、流感[4]等。痘苗病毒天坛株(vacciniavirus Tian Tanstrain,VTT)是中国特有的痘苗病毒毒株,毒力相对较弱,具有高效表达蛋白、无致癌性、宿主细胞范围广等特点,适于多联多价疫苗的研究[5]。本试验以VTT为载体
3、,构建含有4种外源基因的重组痘苗病毒,为多联多价疫苗的研制奠定了基础。 1、材料与方法 1.1细胞、病毒与质粒 BHK-21细胞,VTT由本实验室保存;质粒pSK-TC-EGFP(由上海捷瑞公司合成);pVaxⅠ-Cre(由本实验室构建并保存)[6]。 1.2主要试剂 胎牛血清购自HyClone公司,脂质体Lipofectin2000、OPTI-MEM购自Invitrogen公司,限制性内切酶购自NEB公司。 ExTaqDNA聚合酶、DL2000DNA Marker等均购自大连宝生物工程公司;细胞基因组提取试剂盒购自AXY-GEN公司;总RNA提取试剂盒购自上海生工生
4、物工程公司。 1.3重组质粒的设计与合成 对痘苗病毒天坛株的基因组进行分析,设计TC7L~TK2L两侧重组臂,TC7L为天坛株痘苗病毒全序列从第14757~15248位,共492个碱基,TK2L为天坛株痘苗病毒全序列从第25469~26479位,共1011个碱基;结合痘苗病毒早晚期强复合启动子pE/L和特有的终止信号T5nT,以及外源筛选标记绿色荧光蛋白EGFP基因,构建包含4种外源基因的重组质粒pSK-TC-EGFP。每种外源基因两侧添加有酶切位点,均具有独立的表达框。该穿梭载体质粒由上海捷瑞公司合成。 1.4重组痘苗病毒rVTT-C-4+的构建及筛选 根据脂质体转染使
5、用说明,将重组质粒与VTT共转染BHK-21细胞,步骤如下:用含2%血清的DMEM培养液培养BHK-21细胞,取1105个细胞接入6孔板中,于37℃、5%CO2条件下培养24h,以0.1个感染复数(multiplicity of infection,MOI)的野生型VTT感染BHK-21细胞,感作2h后用重组质粒共转染;培养72h后反复冻融细胞3次以收获病毒,将收获的病毒再次接种于BHK-21细胞,并于1%甲基纤维素环境中培养72h,于荧光显微镜下挑取绿色荧光蚀斑;重复上述筛选过程,直到获得纯化的含EGFP基因的重组痘苗病毒rVTT-C-4+EGFP+。按上述方法将质粒pVaxⅠ
6、-Cre与获得的rVTT-C-4+EGFP+共转染BHK-21细胞,并于1%甲基纤维素环境中培养72h,在荧光显微镜下挑取无绿色荧光的蚀斑;重复上述筛选过程以获得重组痘苗病毒rVTT-C-4+。 1.5重组痘苗病毒rVTT-C-4+的PCR鉴定 提取重组痘苗病毒rVTT-C-4+的基因组为模板,用表1所示5对引物进行PCR。其中CCHF的M基因的反应条件为95℃5min;预热95℃30s,退火54℃30s,延伸72℃30s,30个循环;72℃延伸10min;其余4对引物的退火温度均为58℃,延伸时间1min10s。分别以VTT基因组和重组质粒作为阳性对照,引物序列见表1。
7、 1.6重组痘苗病毒rVTT-C-4+的形态学观察 利用负染法对重组痘苗病毒rVTT-C-4+进行形态学观察。用rVTT-C-4+感染BHK-21细胞,待细胞完全病变后,收集病变细胞,反复冻融3次,3000r/min离心5min,取上清用2%磷酸钨溶液(pH6.8)处理30s,置于电镜下观察。 1.7重组痘苗病毒rVTT-C-4+遗传稳定性的检测分别以重组痘苗病毒第5、10、15、20代重组痘苗病毒的基因组为模板,用如表1所示5对引物进行PCR。其中CCHF的M基因的反应条件
