人呼吸道合胞病毒f蛋白非复制型重组腺病毒构建和鉴定

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1、学位论文独创性声明本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢意。学位论文作者签名：鏊美日期：丝[。￡学位论文使用授权声明本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的

2、学位论文在解密后适用本规定。学位论文作者签名钍导师签名』5百蚀日期：饥。eE1期：2嘶．6．13安徽医科大学硕士学位论文中英文缩略词表AAAdAmpAPDpBSACMVDEPCDMSODTTEBEcoliE．coliBJ5183／PFCSmaKanaPBSrpmPCRAminoacidAdenovirusAmpicillinAmmoniumpersulfateBasepairBovineserumalbumjn氨基酸腺病毒氨苄青霉素过硫酸铵碱基对牛血清白蛋白Cytomegalovirus巨细胞病毒Diethylpyrocarbonate二乙基焦碳酸盐Dimethylsulfoxide二甲

3、基亚砜dithioerythritol二硫苏糖醇Ethylenebromide溴化乙锭Escherichiacoli埃希氏大肠杆菌FetalcalfserumKilodaltonKanamycin含pAdEasy一1E．coliBJ518q-程菌胎牛血清千道尔顿卡那霉素Phosphatebufferedsolution磷酸盐缓冲液roundperminute每分钟转数Polymerasechainreaction聚合酶链式反应安徽医科大学硕士学位论文(续前表)IPTGPMSF丁risrryptoneYeastExtractTEMEDIBSTPMSFwestemblotX—galDMEME

4、CLEDTAIsopropylthio—p—D—galactoside已丙基硫代-B—D-半乳糖苷Phenylmethylsulfonylfluoride苯甲基磺酰氟化物Trishydroxymethhylaminomethane三羧酸甲基氨基甲烷胰蛋白胨酵母粉N，N，N’，N’一tetramethylenediamine四甲基乙二胺"IrisBufferedSalinTween．20Tris缓冲盐水+吐温，20Phenylmethylsulfonylfluoride苯甲基磺酰氟化物蛋白印迹试验5-brom·4-chloro一3一indolylp—D—galactoside5-溴一4一氯

5、一3一吲哚-p—D半乳糖苷Dulbecco’smodifiedEagle’smediumDulbecco改良的Eagle培养液E11llancedl啪incscentcheIIliluIninescent增强化学发光法EthylenediaminetetraaceticacidL--NINLN2安徽医科大学硕士学位论文人呼吸道合胞病毒F蛋白非复制型重组腺病毒的构建与鉴定中文摘要目的：人呼吸道合胞病毒(HumanRespiratorySyncytialVirus，RSV)广泛分布于世界各地，是导致婴幼儿严重下呼吸道感染最重要的病毒病原。病毒感染机体后的免疫保护机制尚未明确，也无特异性防治方

6、法。RSV融合糖蛋白(fusionglycoprotein，F)和吸附蛋白(attachmentglycoprotein，G)是RSV仅有的两种中和抗原。RSV只有一种血清型，主要由于G蛋白抗原性的差异，可进一步分为A和B两种抗原亚型。F蛋白在RSV不同亚型间具有高度的抗原同源性，是主要的交叉保护性抗原。本研究拟克隆RSVF基因，采用非复制型腺病毒载体，利用同源重组方法，构建含有F基因的非复制型腺病毒重组体，获得一株可表达RSVF的非复制型重组腺病毒FGAd／HRSVF，用于体内免疫效果及免疫保护作用的研究。方法：本文根据F基因碱基序列，设计并合成引物，以F基因逆转录产物cDNA为模板，

7、采用高保真DNA聚合酶，PCR扩增，得到F基因编码序列。然后克隆到pGEM．3zf载体中，序列测定正确后，将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1(+)上，酶切鉴定，脂质体法转染COS．7细胞，应用Westernblot方法分析F基因表达情况。将F基因亚克隆于腺病毒穿梭载体pShuttle．CMV，PmeI线性化重组穿梭载体，与腺病毒骨架载体pAdEasy．1在E．coliBJ5183细胞内同源重组得到重组腺病毒DNA质粒。以Pac