糖基化终产物对人肾系膜细胞趋化因子rantes表达的影响

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1、糖基化终产物对人肾系膜细胞趋化因子RANTES表达的影响作者：马丽,孙子林,王少华单位：1.东南大学附属中大医院内分泌科，江苏南京210009；2.武警南京消防医院内科，江苏南京210008【摘要】目的探讨糖基化终产物(AGEs)对人肾系膜细胞(HRMC)趋化因子RANTES表达的影响。方法常规方法制备糖基化终产物（AGEsBSA），干预体外培养的HRMC，收集培养上清和细胞，ELISA法检测上清中RANTES浓度，实时定量RTPCR检测RANTESmRNA表达水平，Westernblot检测RANTES蛋白表达，分别设立

2、同浓度的BSA组及空白对照组作为对照。结果AGEsBSA干预组HRMCRANTESmRNA和蛋白表达水平及上清中RANTES浓度明显高于对照组，并存在浓度和时间依赖效应。结论AGEsBSA上调HRMCRANTES表达和分泌，可能参与糖尿病肾病的发生。【关键词】糖基化终产物；人肾系膜细胞；正常T细胞表达分泌的调节趋化蛋白近年来趋化因子与糖基化终产物（advancedglycosylationendproducts，AGEs）在介导糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）发病中的作用日渐得到人们的关注［1］，

3、我们前期研究观察到糖尿病患者血清AGEs，尤其是小分子的糖基化终产物肽（AGEspeptides，AGEP）、CC亚族趋化因子——单核细胞趋化蛋白1（monocytechemoattractantprotein1，MCP1）和正常T细胞表达分泌的调节活化蛋白（regulateduponactivation，normalTcellexpressedandsecreted，RANTES）均显著高于正常对照，且与糖尿病肾病发生发展相关［2］。本研究旨在细胞水平观察AGEs对人肾系膜细胞（humanre

4、nalmesangialcells，HRMC）表达RANTES的影响,为进一步阐明DN的发病机制提供新的理论依据。1材料和方法1.1材料1.1.1细胞株人肾系膜细胞(HRMC)株，由阮雄中博士(RenalUnit，RoyalFreeHospital，London，UK)惠赠。1.1.2试剂牛血清白蛋白（BSA），DMEM培养基，新生小牛血清，高纯度RNA提取试剂盒和LightCyclerTMFaststartDNAMasterSYBRGreenⅠ试剂盒（德国罗氏），SuperscriptTMⅡRNaseH-逆转录试剂盒（美国I

5、nvitrogen）。RANTES及cyclophilin引物由德国Interactiva合成，人RANTES96孔ELISA试剂盒(法国Immunotech)，RANTES小鼠抗人单克隆抗体IgG（R&D），Erk小鼠抗人单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记兔抗小鼠IgG（美国SantaCruz公司），BCA100蛋白质定量测定试剂盒，PVDF膜（德国罗氏分子生化），化学发光底物和增强剂（美国PiercePico），X线胶片（柯达）。1.1.3仪器和器材CO2恒温培养箱(NAPCO)，LightCycler实时PCR仪（

6、德国罗氏），SCR300电泳仪(上海万达生物工程公司)，紫外检测仪(天能科技有限公司)，洗板机(Model1575，BIORAD产品)，酶标仪(Model550，BIORAD产品)。1.2方法1.2.1AGEsBSA的制备在pH7.4的PBS溶液里加入BSA，使浓度为5.0g•L-1，然后加入葡萄糖使其终浓度为50mmol•L-1，过滤除菌后37℃无菌孵育。使用前以pH7.4PBS溶液透析除去未结合的葡萄糖。对照组BSA中不含葡萄糖，其余条件一致。1.2.2HRMC的培养加入含10%小牛血清的DME

7、M培养液，置于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中，隔日换液，每3d以1∶2传代1次。1.2.3HRMC的干预将处于对数生长期的HRMC移入6孔板中，待细胞长到次融合状态(细胞计数约为2×106)后换用无血清DMEM培养24h，然后分组干预：(1)用同一浓度（400mg•L-1）的AGEBSA干预6、12、24、48h，以同浓度BSA组作为对照；(2)以不同浓度（50、100、200、400、800mg•L-1）的AGEBSA干预HRMC48h，以空白对照组作为对照。1.2.4实时定量RT

8、PCR检测细胞RANTESmRNA的表达按照试剂盒说明书进行总RNA的提取、cDNA逆转录合成及PCR反应。cyclophilin的引物：上游5′ATGGTCAACCCCACCGTGT3′，下游5′GACAAGGTCCCAAAGACA