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1、糖基化终产物对人肾系膜细胞MMP2表达的影响作者：杨益宁，孙子林，杨涛，马婵娟，马里，刘乃丰[摘要]目的:观察糖基化终产物（advancedglycosylationendproducts,AGEs）对人肾系膜细胞(humanrenalmesangialcell，HRMC)基质金属蛋白酶2（matrixmetalloprotEinase，MMP2）表达的影响。方法:运用糖基化修饰的牛血清白蛋白（AGEBSA）干预体外培养的HRMC，MP2蛋白表达。结果:HRMC的MMP2蛋白表达水平随AGEBSA浓度增加和干预时间延长而降低（P＜
2、0.01）。结论:MMP2可能参与AGEs所致的糖尿病肾病的发生发展。[关键词]基质金属蛋白酶；人肾系膜细胞；糖基化终产物；糖尿病肾病糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN）特征性的病理改变为细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）积聚和基底膜增厚。系膜基质的成分与含量决定于基质合成与降解两者之间的平衡。基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase,MMP2)是重要的ECM降解酶，它定位于肾小球，由结缔组织细胞分泌，主要参与Ⅳ型胶原的降解，而后者是DN时肾小球基底膜增厚和系
3、膜基质堆积的主要成分，因此与DN的关系非常密切。持续高血糖状态下体内蛋白质发生非酶糖基化反应和最后形成的糖基化终末产物（advancedglycationendproducts，AGEs）在DN发生机制中具有重要意义，已有研究显示AGEs能降低大鼠肾小球系膜细胞MMP2表达和活性[1]。本研究以体外培养的人肾系膜细胞(HRMC)为模型，进一步观察AGEs对MMP2蛋白表达的影响。 1材料与方法1.1主要试剂牛血清白蛋白(AMRESCO产品),DMEM培养基(GIBCO产品，低糖型),小牛血清(兰州民海生物),蛋白抽提试剂（上海申能
4、博彩）,SDSPAGE试剂(上海凯基生物),预染标准蛋白质Marker（北京天为时代）,GAPDH（上海康成）,MMP2单克隆抗体和兔抗鼠辣根过氧化酶抗体（美国SantaCruz公司）,DAB显色试剂（上海申能博彩）,其他试剂均为国产分析纯。1.2AGEBSA的制备在pH7.4的PBS溶液里加入BSA和葡萄糖，使BSA的终浓度为5.0g・L-1，葡萄糖的终浓度为50mmol・L-1，充分溶解后过滤除菌，37℃无菌孵育90d。孵育结束后以pH7.4PBS溶液透析除去未结合的葡萄糖。对照组BSA中不含葡萄糖
5、，其余条件一致。荧光光谱扫描(激发波长390nm，发射波长450nm，狭缝5nm)鉴定AGEBSA。1.3细胞培养和干预HRMC株由阮雄中博士（RenalUnit，RoyalFreeHospital，LONDON，UK）惠赠,将其置于37℃、CO2体积分数为5%的饱和湿度培养箱。培养液为含10%小牛血清的DMEM，每2~3d更换1次培养液。将处于对数生长期的细胞按1∶3移入6孔板中，待细胞生长至80%～90%融合时换用无血清的DMEM同步化饥饿24h，按下列分组进行干预，同时设DMEM对照组及BSA对照组，3孔细胞作为1组。不同浓
6、度的AGEBSA(50、100、200、400、800mg・L-1)与HRMC共孵育24h，浓度为200mg・L-1的AGEBSA干预HRMC8、16、24、48和72h。1.4MP2蛋白表达裂解HRMC提取总蛋白，以Bradford法检测总蛋白浓度。在10%SDSPAGE分离胶上覆盖5%的积层胶,取10μl蛋白质样品按1∶1比例与2×加样缓冲液(0.15mol・L-1Tris,10%SDS,0.03%溴酚蓝,pH6.8)混合,95℃5min变性后上样。电泳后将凝胶依次进行半干电转移、5%
7、脱脂牛奶封闭1h、一抗孵育过夜、二抗孵育、DAB显色。扫描PVDF膜并对电泳条带进行光密度分析。以GAPDH作为上样对照，靶蛋白条带密度与内参条带密度的比值作为各组实验数据，每组实验重复3次。1.5统计学处理应用SPSS11.5软件包进行统计,数据用x-±s表示,采用onewayANOVA进行组间比较，以P＜0.05为差异有显著性。2结果2.1不同浓度的AGEBSA对HRMCMMP2蛋白水平的影响如图1所示，AGEBSA在浓度为50mg・L-1时，细胞的MMP2蛋白表达即已降低，与DMEM组和BSA(800mg
8、2539;L-1)组相比，P＜0.01。并且，随着AGEBSA浓度的增高，细胞的MMP2蛋白表达进一步降低，至800mg・L-1时为最低。各AGEBSA组与DMEM组和BSA(800mg・L-1)组相比均有显著性差异，P
