宁夏地区绵羊博尔纳病病毒自然感染状况研究

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1、宁夏地区绵羊博尔纳病病毒自然感染状况研究作者：刘建，马彦，王振海，谢鹏【摘要】目的探讨中国宁夏地区绵羊博尔纳病病毒(Bornadiseasevirus，BDV)的自然感染状况，并分析比较中国宁夏地区绵羊自然感染BDVp24基因序列与国外人和动物来源BDV分离株及其标准株StrainV和He/80的同源性。方法采用巢式逆转录荧光定量PCR(FQ-nRT-PCR技术)检测了中国宁夏地区268例绵羊PBMCs中BDVp24基因片段，对阳性标本FQ-PCR产物进行基因序列测定，测序结果应用BLAST软件以及DNAsist5

2、.0软件对测序结果分析，与国外人与动物来源的BDV分离株以及标准株StrainV和He/80进行序列比较。结果268例中4例绵羊外周血BDVp24基因片段阳性，阳性率为1.49%;测序分析结果表明，宁夏地区绵羊感染的BDVp24的核苷酸序列与马源性病毒株H3575同源性最近，同源性为98.84%(85/86)，与标准株StrainV和He/80同源性为94.19%和100%。并且它们编码的氨基酸序列相同。结论宁夏地区绵羊中可能存在动物源性的BDV自然感染，该地区感染的BDVp24核苷酸序列与马源性病毒株H3575、

3、标准株StrainV和He/80存在高度的同源性，其感染来源可能相同亦或存在相互之间感染的可能【关键词】Borna病病毒;感染;巢式逆转录荧光定量PCR12博尔纳病病毒(Bornadiseasevirus，BDV)是一种非分节段的单股负链嗜神经的RNA病毒，是引起人和动物共患病博尔纳病(BornaDisease，BD)的病原体[2]，感染后主要侵犯中枢神经系统导致严重后果，有可能引起动物之间的传染而引起大规模动物死亡。迄今为止，中国虽未见大规模的BDV流行报道，但有报道在新疆、重庆、宁夏以及台湾地区的马、牛、人等存

4、在散在BDV自然感染。本研究应用FQ-nRT-PCR技术检测宁夏地区268例绵羊外周血单个核细胞(PBMCs)中BDVp24基因片段，对阳性标本FQ-PCR产物进行克隆和测序分析，以探讨中国宁夏地区绵羊BDV自然感染状况，进而比较分析中国绵羊自然感染的BDV与国外人和动物来源BDV分离株及其标准株StrainV和He/80在种系发生中的关系。　　1材料和方法　　1.1研究对象268例绵羊均来自宁夏地区，每例采外周血5mL，EDTA抗凝。　　1.2主要试剂及仪器主要试剂：淋巴细胞分离液(Ficoll-conray液)

5、，TrizolRNA提取液(购自BioFlux)，Borna病病毒荧光定量PCR诊断试剂盒(广州达晖生物技术有限公司)，PE7700FQ-PCR(美国ABI公司)。12　　主要实验仪器：752紫外光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)，Bio-RadPCR仪(日本)，Heraeus低温高速离心机(德国)，Rotor-Gene6000荧光PCR仪(澳大利亚)，SANYOULTRALOW冰箱(日本)。　　1.3方法　　1.3.1RNA的提取及质量检测1)提取细胞内总RNA：将采集的EDTA抗凝的5mL血用人淋巴细胞分离液

6、分离PBMCs，再按照RNAisoTMPlusRNA提取试剂提取总RNA。提取的RNA保存在-80℃冰箱。2)对RNA样本进行纯度检测、浓度计算和完整性检测：将上述保存于-70℃冰箱中的绵羊PBMCsRNA样本随机取出4例，4℃8000r·min-1离心5min，弃上清液;再用75%乙醇重复洗涤，4℃8000·min-1离心5min，吸干残余液，RNA沉淀置室温干燥15min去除残留乙醇;加入无RNase水50μL，55℃水浴10～15min溶解RNA;取5μL提取的RNA稀释100倍，用紫外分光光度计测OD260

7、、OD280及二者比值，计算RNA浓度，公式为：OD260×核酸稀释倍数×40/1000，单位μg·μL-1。其余RNA置-70℃冰箱中备用。采用1%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭浓度为0.5μg·μL-1)电泳。取RNA样品10μL上样，以3～4V·12cm-1的电压电泳25min，在凝胶成像分析仪中观察结果并照相。3)FQ-nRT-PCR检测BDVp24基因片段阳性定量标准曲线的建立：将鉴定好的质粒(重庆医科大学提供)测定OD值，计算拷贝数，按107、106、105、104、103拷贝数·μL-1浓度梯度稀释，加5μL

8、于不同反应管中，在PE7700FQ-PCR上进行扩增。同时每8s检测1次PCR产物的量(即反应管中荧光值Rn的变化)。其原理是在常规PCR基础上，在反应体系中加入了一种带有2个荧光基团标记的特异性寡核苷酸探针进行FQ-PCR。所有反应信息资料被Opticon-2FQ-PCR扩增仪收集并储存于其附件Macintosh电脑分析软件中，反应结束后该电脑根据阳性定量