宁夏地区黄牛博尔纳病病毒自然感染状况的探讨

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1、宁夏地区黄牛博尔纳病病毒自然感染状况的探讨作者：马彦，王振海，孔繁元，谢鹏【摘要】目的了解宁夏地区黄牛博尔纳病病毒(Bornadiseasevirus，BDV)的自然感染情况，对检测到的BDVp24基因阳性扩增片段进行核苷酸序列比对，探讨其与国际标准病毒株及其分离株的同源性。方法采用荧光定量巢式逆转录酶聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)检测宁夏地区205例健康牛外周血单个核细胞(PBMCs)BDVp24基因片段，并对其中的阳性扩增产物进行基因序列测定，然后应用BLAST软件以及DNAsist5.0软件对测序结果分析。结

2、果205例中3例阳性，阳性率为1.5%;该BDVp24片段的核苷酸序列与StrainH3915同源性最高达97.67%，与标准病毒株H1766同源性为96.51%，与StrainV/FR的同源性为95.35%，且它们编码的氨基酸相同。结论宁夏地区黄牛中存在动物源性BDV的自然感染，该BDVp24核苷酸序列与标准病毒株具有高度同源性。【关键词】博尔纳病病毒;荧光定量巢式逆转录酶聚合酶链反应;牛外周血;宁夏博尔纳病病毒(Bornadiseasevirus，BDV)是非细胞溶解性的、负链、单股的RNA8嗜神经病毒。研究表明，B

3、DV具有广泛感染宿主，可感染鸡、山羊、兔、驴、骆驼、羊驼、牛、狗、猫、驼鸟以及人等在内的几乎所有温血动物，并引发Borna病(Bornadisease，BD)，临床表现为致死性中枢神经系统损害，以行为异常、脑实质和脑膜的炎性细胞浸润，以及疾病特异性抗原在边缘系统中积聚为特征。目前尚未见中国牛感染BDV的文献报道，特对宁夏地区黄牛进行了BDV感染的检测，现报告如下。　　1材料与方法　　1.1材料205例健康成年黄牛均来自宁夏地区，每例取外周乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血5mL。　　1.2方法试剂和其它材料包括：Ficoll

4、-conray液，TrizolRNA提取抽提剂(购自BioFlux)，BDVp24荧光定量PCR检测试剂盒(购自广州达晖生物技术有限公司)。BDVp24基因扩增产物及探针序列：外引物P1为5’-TGACCCAAACCAGTAGACCA-3’(19bp)，P2为5’-GTCCCATTCATCCGTTGTC-3’(19bp);内引物P1为5’-CCCTCCAAGTGGAAACCAT-3’(19bp)，P2为5’-CAGTATCTTGATGTTCTCGCCA-3’(22bp);荧光探针为5’-FAM-TCAGCGGTGCGAC

5、CACTCCGATAGC-TAMRA-3’8(25bp)。BDV重组质粒由重庆医科大学神经病学研究所提供。采集EDTA抗凝外周血各5mL，分别用Ficoll-conray液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs)，采用Trizol一步法提取细胞总RNA，标本置-80℃保存备用。然后进行(1)RNA完整性检测：采用1%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭浓度为0.5%)电泳。取RNA样品5μL加样，以3～4V/cm电压电泳25min，在凝胶扫描系统中观察结果并照相。(2)BDV质粒标准曲线制作：将重组质粒定量后作为阳性模板，稀释

6、至107、106、105、104、103、102拷贝·μL-1浓度梯度，于Roter-gene6000型扩增检测仪上进行PCR扩增，由电脑自动分析出定量结果，并给出PCR扩增的动力学曲线。(3)FQ-nRT-PCR检测BDVp24基因片段(按照BDVp24荧光定量PCR检测试剂盒说明进行)：首先进行逆转录反应，在含RNA的Ep管中加入7μL逆转录体系反应液Ⅰ，逆转录酶1μL，DEPC水7μL，总反应体积为20μL，于37℃持续1h;然后取逆转录产物5μL，加入反应液Ⅱ8μL，TaqDNA聚合酶1μL，去离子水11μL，反

7、应体积为25μL，进行PCR第一步扩增：93℃4min预变性，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，循环20个周期;再取PCR第一步扩增产物5μL，加入反应液Ⅲ14μL，TaqDNA聚合酶1μL，去离子水30μL，反应体积为50μL，进行PCR第二步扩增：93℃3min预变性，93℃变性45s，55℃延伸60s，共循环40个周期。每次实验均设阴性对照。(4)PCR扩增阳性产物的鉴定和序列分析：将BDVp24基因片段阳性PCR第二步扩增产物5μL加样，以2%琼脂糖110V电压60mA电流电泳35min，在

8、凝胶成像系统中扫描并照相。可见与目的基因片段相同分子量大小86bp电泳条带。将BDVp24基因片段阳性的扩增产物送上海英骏生物技术有限公司进行克隆和基因测序。8　　2结果　　2.1RNA的提取质量取3份阳性样本的PBMCs细胞总RNA，用1%琼脂糖电泳，可见28s、18s2条清晰的条带和稍欠清晰的5s条带(见图1)。