宁夏绵羊脑组织博尔纳病病毒的自然感染状况

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1、宁夏绵羊脑组织博尔纳病病毒的自然感染状况【摘要】目的了解宁夏地区绵羊脑组织博尔纳病病毒(Bornadiseasevirus，BDV)的自然感染情况，并分析其与德国马源性标准病毒株He/80的同源性。方法应用荧光定量巢式逆转录PCR(FQ-nRT-PCR)和RT-PCR分别检测宁夏地区163例绵羊脑组织中BDVp24、BDVp40基因片段，并对BDVp24阳性扩增产物进行测序，与国外标准病毒株进行比较。结果163例绵羊脑组织中6例BDVp24、BDVp40均阳性，阳性率为3.68%(6/163)。测序后经基因序列比

2、对，本实验检测阳性BDVp24片段的核苷酸序列与He/80同源性为100%。结论宁夏地区绵羊脑组织中可能存在动物源性BDV的隐性感染，阳性BDVp24核苷酸序列与He/80具有高度同源性。【关键词】博尔纳病病毒BDVp24基因;BDVp40基因;荧光定量巢式逆转录PCR;绵羊脑组织　博尔纳病病毒(Bornadisease11virus，BDV)是一种高度嗜神经的非节段性负链RNA病毒，可以引起散发的脑脊髓炎。BDV可以感染从鸟类到非人灵长类的广泛的动物种属，表现出神经病学和行为学的异常[1]。人类的BDV感染可能

3、与部分神经精神疾病的发病有关[2]。我国新疆、重庆、台湾等地区的马和牛等已报道存在散在的BDV自然感染。大量的研究表明在德国、日本、美国的精神病和神经病患者中存在BDV特异性抗体[3]。本课题组前期研究已证实宁夏地区牛、羊的外周血单核细胞(peripheralbloodmonouclearcells，PBMC)及病毒性脑炎病人PBMC和脑脊液中存在BDV[4-6]，说明宁夏地区存在BDV的自然感染，但目前还没有宁夏地区绵羊脑组织BDV检测的报道。本研究通过对宁夏163例健康成年绵羊脑组织进行BDV感染的检测，现报

4、告如下。　　1材料和方法　　1.1研究对象本研究中163例成年绵羊均来自宁夏地区，每例取颞叶脑组织约50g，于-80℃保存备用。　　1.2试剂TrizolRNA提取抽提剂(购自BioFlux)，荧光定量PCR检测试剂盒(购自广州达晖生物技术有限公司)。BDVp24重组质粒由重庆医科大学神经病学研究中心提供。　　1.3仪器752紫外光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂);Bio-RadPCR仪(日本);Heraeus低温高速离心机(德国);Rotor-Gene6000荧光PCR仪(澳大利亚);SANYOULTRALO

5、W冰箱(日本)。　　1.4BDV11p24基因片段的引物和探针根据GeneBank中BDV的第二开放阅读框(ORGⅡ)区核苷酸序列设计了2对引物：外引物p1为5'-TCAGACCCAGACCAGCGAA-3'，p2为5'-ATCTGGGGATAAATGCGCG-3';内引物p1为5'-CCCTCCAAGTGGAAACCAT-3'，p2为5'-CAGTATCTTGATGTTCTCGCCA-3';荧光探针为5'-(FAM)-TCAGCGGTGCGACCACTCCGATAGC-(TAMRA)-3'(由上海英骏生物有限公

6、司合成)。PCR产物长度为86bp。　　1.5BDVp40基因片段的引物根据BDVp40蛋白的核苷酸序列设计了1对引物，上游引物：5-AGTCACCGCGCGATAGTTT-3',下游引物：5'-CGACAGGTAGGATTCACGAGGC-3'，由上海英骏生物有限公司合成。PCR产物长度为154bp。　　1.6方法　　1.6.1脑组织总RNA的提取及质量检测将-80℃保存的绵羊脑组织取适量放入1.5mLEP管中，按BioFlux的TrizolRNA提取试剂盒说明书提取总RNA,-80℃冰箱保存备用。随机取上述提

7、取RNA样品4份，用紫外分光光度计测定OD260、OD280，并计算二者的比值分析其纯度。然后进行1%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭浓度为0.5%)电泳，以3～4V·cm-1电压电泳25min，分析RNA完整性。　　1.6.2BDV11p24质粒标准曲线制作将鉴定好的质粒测定OD值，计算出拷贝数，按107、106、105、104、103、102拷贝数·μL-1的浓度梯度稀释作为阳性模板，在Rotor-Gene6000荧光PCR仪上进行扩增，每8s检测1次PCR产物的量(即反应管中荧光值Rn的变化),每次六个梯度阳性对照均

8、扩增成功,根据阳性定量标准模板的扩增情况绘制标准曲线，扩增曲线呈S形，阴性对照无荧光量改变。　　1.6.3FQ-nRT-PCR检测BDVp24基因片段逆转录反应：在含样本RNA的EP管中加入下列逆转录体系进行反应：5×逆转录缓冲液(含25mmMgCl2)2μL，外上游引物0.2μL，外下游引物0.2μL，10mMdNTP0.1μL，逆转录酶0.5μL，DEPC水2μL，总