病毒性脑炎的诊断及博尔纳病病毒p24基因片段的检

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1、病毒性脑炎的诊断及博尔纳病病毒p24基因片段的检【摘要】目的探讨脑脊液(CSF)、脑电图(EEG)、MRI对于病毒性脑炎的诊断价值，并检测病毒性脑炎患者外周血单个核细胞(PBMCs)中博尔纳病病毒(BDV)p24基因片段，探讨病毒性脑炎与BDV感染的关系。方法回顾性分析病毒性脑炎患者的CSF、EEG、MRI的阳性检出率并进行比较，用荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)方法检测病毒性脑炎患者及对照者PBMCs中BDVp24基因片段，并总结阳性患者的临床特征。结果CSF、EEG、MRI检查结果比较，C

2、SF高于MRI检查结果阳性率(χ2=9.6，P＜0.01)；CSF高于EEG检查结果阳性率(χ2=7.58，P＜0.01)；MRI检查阳性率高于EEG(χ2=5.82，P＜0.01)。PBMCs中BDVp24基因片段检测结果显示实验组4例阳性，对照组均为阴性。4例BDVp24基因片段阳性患者主要以发热、头痛、颅内压增高症状为主。结论脑脊液、MRI对病毒性脑炎的诊断价值优于EEG，部分病毒性脑炎的发生与BDV感染有关，主要以发热、头痛、颅内压增高为临床特征。【关键词】病毒性脑炎；脑脊液；博尔纳病病毒；荧光定量巢式逆转

3、录聚合酶链反应病毒性脑炎(Virusencephalitis，VE)的诊断主要靠临床症状、体征和脑脊液(CSF)检查。临床常出现发热、头痛、精神行为异常以及意识水平的改变，可伴有局灶性神经缺损和癫痫发作。博尔纳病病毒(BDV)是一种中枢神经系统新发感染性病毒，研究表明其与人类某些神经精神疾病的发病有关［1］。本文拟探讨CSF、脑电图(EEG)和MRI对VE的诊断价值，并检测BDVp24基因片段以探讨其与VE的关系。1资料与方法1.1一般资料实验组50例(男27例，女23例)，年龄15～78岁，平均34.336岁，均

4、为宁夏医科大学附属医院神经内科2007年7月—2008年7月间的住院患者。正常对照组60例(男33例，女27例)，年龄18～75岁，平均53.662岁，均来自本院健康体检者。实验组50例均符合《临床神经病学》病毒性脑炎的诊断标准：①临床上有似病毒感染所致脑实质受损征象；②脑脊液有或无炎症性改变，均查不到细菌(包括结核、霉菌等)感染的证据；③脑电图呈弥漫性异常(有些可局灶化)，脑扫描、造影、MRI等检查无占位性病变征象(单纯疱疹病毒脑炎和某些局灶性脑炎例外)；④血清抗体滴度明显增高(特别是恢复期比急性期高4倍以上)。

5、并排除结核性脑膜炎、化脓性脑膜炎等颅内感染。实验组和对照组一般情况差异无统计学意义。1.2方法脑脊液采用英国Shandon公司Cytospin－2型细胞波片离心沉淀仪收集，应用迈—格—姬染色法染色。细胞学诊断参照实用脑脊液细胞学彩色图谱［2］。脑电图检测均采用日本光电32道数字化视觉脑电监测仪，评定参考刘晓燕《临床脑电图学》［3］标准。颅脑MRI采用美国GE公司1.5TSignaInfinityTm，间隔2mm，横断面、矢状面及冠状面T1-TCAGCGGTGCGACCACTCCGATAGC-TAMRA-3(25bp

6、)。采集每例患者及对照者EDTA抗凝外周血液各5mL，分别用Ficoll-conray液密度梯度离心法分离外周血液单个核细胞(PBMC)，采用Trizol一步法提取细胞总RNA，标本置－80℃保存备用。然后进行(1)RNA完整性检测：采用1％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭浓度为0.5％)电泳。取RNA样品5μL加样，以3～4V/cm电压电泳1h，在凝胶扫描系统中观察结果并照相。(2)BDV质粒标准曲线制作：将重组质粒定量后作为阳性模板，稀释完全107、106、105、104、103拷贝/μL浓度梯度，在澳大利亚Rcorbe

7、tt型扩增检测仪上进行PCR扩增，由电脑自动分析出定量结果，并给出PCR扩增的动力学曲线。(3)FQ-nRT-PCR检测BDVp24基因片段：首先进行逆转录反应，在含RNA的Ep管中加入逆转录体系反应液Ⅰ7μL，逆转录酶1μL，DEPC水7μL，总反应体积为20μL，于37℃持续1h．然后取逆转录产物5μL，加入反应液Ⅱ8μL，TaqDNA聚合酶1μL，去离子水11μL，反应体积为25μL，进行PCR第一步扩增:93℃4min预变性，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，循环20个周期。再取PCR

8、第一步扩增产物5μL，加入反应液Ⅲ14μL，TaqDNA聚合酶1μL，去离子水30μL，反应体积为50μL，进行PCR第二步扩增：93℃3min预变性，93℃变性45s，55℃延伸60s，共循环40个周期。每次实验均设阴性对照。(4)PCR扩增阳性产物的鉴定和序列分析：将BDVp24基因片段阳性PCR第二步扩增产物5μL加样，以2％琼脂糖3～4V/cm电压电