博尔纳病病毒对人少突胶质细胞增殖与凋亡影响的初步研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文博尔纳病病毒对人少突胶质细胞增殖与凋亡影响的初步研究姓名：邓婧申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：谢鹏201205重庆医科大学硕士研究生学位论文博尔纳病病毒对人少突胶质细胞增殖与凋亡影响的初步研究摘要背景及目的：博尔纳病病毒(Bomadiseasevirus，BDV)是一种非细胞毒性的、单股负链的砌悄病毒，具有高度嗜神经细胞特性，能引起中枢神经系统持续病毒感染，BDV宿主范围很广，据报道可引起鼠、马、兔、狗等多种温血类动物的自然感染或实验室感染，并表现出以明显的精神、行为异常等为特征的神经精神临床症状。同时，大量国内外的的流行病学调查显示BDV感染可能与人类某

2、些精神神经疾病的发生有一定联系，BDV能感染神经元和神经胶质细胞，引起神经细胞可塑性、代谢分泌功能改变，但感染具体机制研究国内外报道较少，其中BDV对神经胶质细胞的感染机制研究：更为少见。本研究通过BDV实验感染人少突胶质细胞(o·ligodendrocytecells，OLcells)，针对血清浓度单因素改变对BDV病毒滴度结果的影响进行比较，探讨选择BDV感染细胞适宜的血清浓度，以进一步开展BDV感染神经细胞研究，另一方面在最适宜血清浓度培养条件下用病毒感染细胞，观察其对0L细胞的增殖生长和凋亡的影响，并探讨病毒致病相关分子机制。本课题由国家重点基础研究发展计划(973计划，项目编号2

3、()09CB918302)资助重庆医科大学硕士研究生学位论文方法：1复苏0L／BDV3660株细胞，通过反复冻融方式获取病毒液。将OL细胞在含不同浓度f?BS的DMEM液条件下进行培养，同时制备不同稀释倍数的病毒液，依次用不同稀释浓度的病毒液感染细胞，常规培养7日后，通过免疫组化方法检测病毒阳性细胞集落数，计算出最适合该病毒感染少突胶质细胞的血清浓度。2培养0L细胞，：9口入BDV病毒液感染CIL细胞，通过BDV核蛋白免疫荧光实验鉴定BDV感染是否成功，以建立BDV感染的OL细胞模型。3采用CCK8试剂j盒，分别测定BDV感染0L细胞1～7天的生长增殖情况，绘制生长曲线。同时采用流式细胞技

4、术测定BDV感染0L细胞24内不同时间点，细胞周期各期的DNA含量，观察感染对增殖能力的影响。收集BDV感染1、3、5天的0L细胞，采用流式细胞技术，测定凋亡细胞数目。4培养细胞，分别提取BDV感染1、3、5天的OL细胞蛋白，采用Wrestem_blot方法检测凋亡相关指标Bcl．2、BaX的蛋白相对表达量变化。结果：1病毒滴度测定后!显示，在2％FBS培养条件下，病毒滴度测定值相比其它几种培养条件更高。2通过免疫荧光鉴定发现，BDV感染0L细胞3天和5天时，均可发现P40蛋白绿色荧光表达，说明BDV感染0L细胞成功。4重庆医科大学硕士研究生学位论文3通过CCK8试剂盒测定OL细胞增殖能力

5、发现，BDV感染细胞7天内，随着时间的增加，细胞的数量逐渐增多。但与对照组0L细胞相比，感染组细胞的增殖能力明显更低(P<0．05)。4采用流式细胞技7R测定BDV感染OL细胞24小时内的周期变化发现，感染细胞周期G2期延迟，细胞增殖指数降低。采用流式细胞技术测定凋亡细胞数目发现，在BDV感染OL细胞3天和5天时，感染组检测到的凋亡细胞数明显多于对照组细胞(f，<0．05)。5采用Westem-blot免疫印迹方法检测凋亡相关标志物Bcl．2、Bax的蛋白相对表达量发现，在感染3天和感染5天时，感染组细胞的促凋亡标志Bax的蛋白表达量明显高于对照组细胞；而感染组细胞抑凋亡标志Bcl．2的蛋

6、白表达量明显低于对照组(P<0．05)。结论：1不同浓度血清的病毒培养条件可影响BDV对细胞的感染力，2％FBS的培养条件可能更适合于BDV感染OL细胞实验。2BDV感染可以抑制OL细胞增殖生长，并可能通过上调BaX蛋白和下调Bcl．2蛋白的相对表达量，从而参与诱导细胞凋亡的发生。关键词：博尔纳病病毒，少突胶质细胞，血清浓度，病毒滴度，细胞增殖，细胞凋亡重庆医科大学硕士研究生学位论文THEEFFECToNPRoLIFERATIoNANDAPoPToSISOFoLIGODENDROCYTECELLINFECTEDBYBoRNADISEASEVIRUSABSTRACTBacl噜roundand

7、ObjectiVe：BomadiseaseVims(BDV)，isanonseg：111ented，negatiVesingle-strandedRNAVims．Itishi曲tlyneurotr《)pic，whichcouldcausepersistentinfectionofthecentralnerV()ussystem(CNS)．Ithaswidehostrange，anditcouldcausenaturein