cd158a表达调节胃癌患者ctl细胞功能的体外研究

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1、CD158a表达调节胃癌患者CTL细胞功能的体外研究作者：刘振华,陈晓耕，林孟波，黄毅【摘要】　　目的研究CD158a表达对胃癌CTL细胞体外功能的影响。方法利用免疫磁珠法分选培养表达与不表达CD158a的两型细胞，MTT法测定其体外杀伤胃癌MNK45细胞的活性，Elispot试验检测其分泌细胞因子的变化，RTPCR方法检测其mRNA的表达差异及CD158a受体激发后(Trigerring)的细胞毒T细胞凋亡情况。结果CD158a+CTL几乎不杀伤人胃癌MNK45细胞，但阻断相应CD158a分子或靶细胞MHC1分子后，杀伤活性得到一定

2、程度恢复。CD158a-CTL以分泌γIFN为主，参与Th1反应，而CD158a+CTL主要分泌IL4，可能介导Th2反应。3例胃癌患者的CD158a+CTL细胞均可扩增出300bp的P58.2cDNA特征性条带。CD158a分子激发后，CD158a+CTL凋亡细胞具有显著的形态学特征，DNA电泳有典型的“ladder”梯型条带。结论CD158a表达抑制胃癌CTL体外杀瘤活性，影响其细胞因子的分泌，并在激发后诱导CTL细胞凋亡。【关键词】胃肿瘤T淋巴细胞细胞毒性杀伤细胞天然受休细胞表面　　近年来，杀伤细胞抑制受体(killerinhi

3、bitionreceptor,13KIR)的发现丰富了学者对肿瘤免疫调节的认识。KIR主要表达于人自然杀伤(NK)细胞和某些T淋巴细胞，其中的CD158a分子属于P58.1超家族，相对应人白细胞抗原(HLA)配基为HLACW2、4、5、6血清型。通过与主要组织相容性复合物抗原Ⅰ类分子(MHCⅠ)结合，传递负性调控信号，在机体抗肿瘤免疫及移植排斥中发挥重要调节作用。Gati等研究表明，来源于肾癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的细胞毒性T细胞(CTL)表面KIR分子可下调CTL杀瘤效能，认为KIR表达是CD8+CTL免疫无能的主要机制，揭示CD

4、158a分子有助于免疫逃逸[1]。本研究旨在揭示CD158a表达对胃癌CTL细胞体外功能的影响。　　1材料和方法　　1.1胃癌患者T细胞表达CD158a测定参照文献[2]的方法，分离3例患者T细胞及诱导CTL细胞，采用直接免疫荧光标记技术，分别标记抗体FITCDX27(antiCD158a，IgG1，美国Immunotech公司)，设同型、同标记鼠抗人单抗作空白对照。检测3例患者的分离新鲜T细胞及其CTL细胞表达CD158a的情况。　　1.2CD158a+CTL与CD158a-CTL的分选培养利用有限稀释克隆技术，当阳性孔克隆细胞生长

5、到一定数量级(每孔105时，利用荧光标记单抗结合流式细胞仪检测其表型，标记后作相应培养、扩增，AIMV培养基含rIL2800IU/mL(北京瑞得一合通公司)。每3～513d换液1次，每周添加1次抗原及维持量的rIL2(400IU/mL)以维持CTL细胞活性。免疫磁珠法分选两型细胞，具体操作参见说明书(美国Stemcells公司)。　　1.3CD158a+CTL与CD158a-CTL细胞的体外杀瘤活性人胃癌MNK45细胞由苏州大学医学院张学光教授惠赠。体外杀瘤活性检测取效∶靶比(10∶1)，MTT法测定[3]，λ=490nm，计算公式

6、为：　　杀伤活性(%)=(D实验孔-D阴性对照)/D无杀伤对照×100%　　每组设三复孔，实验中，只有靶细胞孔为无杀伤对照，效应细胞孔为阴性对照孔。杀伤阻断试验选用单抗为抗HLAA、B、C单抗及抗CD158a单抗(即DX27，美国Pharmingen公司)[4]。均以5μg/mL作用于相应细胞，37℃孵育2h，以PBS洗去未结合抗体，然后再测定相应体外杀伤活性。　　1.4RTPCR检测CD158a分子mRNA表达应用Trizol试剂法提取CD158a+CTL细胞总RNA，RTPCR应用瑞士罗氏公司(Roche)生产的TitanRT

7、PCR试剂盒。KIR引物的设计与合成参照文献[5]，委托上海生工公司合成。　　KIR(402bp)：13　　上游：5’TTCCCTCCTGGCCCACCCA3’　　下游：5’TCCCTGGATAGATGGTACA3’　　βactin(548bp)：　　上游：5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3’　　下游：5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTC3’　　1.5CD158a+CTL与CD158a-CTL分泌γIFN及IL4的检测采用Elispot试验[6],略作修改。主要试剂均购自深圳晶美生物工程公司

8、。抗γIFN或抗人IL4单抗15μg/mL包被96孔酶联检测板(Nunc)，4℃过夜;洗板，CD158a+CTL与CD158a-CTL以含10mmol/LHEPES的RPMI1640液配成